質(zhì)膜Ca2+-ATP酶異構(gòu)體2基因多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系*

鄧嘉虹，金　磊

(1.云南省第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，昆明 650032；2.云南省昆明市延安醫(yī)院耳鼻喉科　650000)

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論著·臨床研究

質(zhì)膜Ca2+-ATP酶異構(gòu)體2基因多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系*

鄧嘉虹1，金磊2△

(1.云南省第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，昆明 650032；2.云南省昆明市延安醫(yī)院耳鼻喉科650000)

[摘要]目的探討質(zhì)膜Ca2+-ATP酶異構(gòu)體2(PMCA2)基因的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系。方法采用分組研究的方法，對(duì)164名受檢者進(jìn)行調(diào)查和聽(tīng)力測(cè)試，按聽(tīng)力學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果將其分為感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的突發(fā)性耳聾組(n=82)和聽(tīng)力正常組(n=82)；用PCR和等位基因特意擴(kuò)增法檢測(cè)PMCA2基因上rs2289274和rs6790640兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性。結(jié)果在突發(fā)性耳聾組中，rs2289274位點(diǎn)基因型頻率分別為AA 55.8%，AG 17.4%，GG 26.8%，等位基因頻率A 64.5%和G 35.5%。在聽(tīng)力正常組中，rs2289274位點(diǎn)基因型頻率分別為AA 26.8%，AG 28.0%，GG 45.2%，等位基因頻率A 41.1%和G 58.9% 。在突發(fā)性耳聾組中，rs6790640位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 18.3%，CT 35.4%，TT 46.3%，等位基因頻率C 36.3%和T 63.7%。在聽(tīng)力正?；颊呓M中，rs6790640位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 2.4%，CT 63.4%，TT 34.1%，等位基因頻率C 34.1%和G 65.9% 。兩位點(diǎn)的基因型分布及其等位基因頻率在突發(fā)性耳聾組和聽(tīng)力正?；颊呓M之間部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)MCA2基因rs2289274和rs6790640兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性可能是突發(fā)性耳聾的遺傳易感性因素。

[關(guān)鍵詞]鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶類；質(zhì)膜Ca2+-ATP酶異構(gòu)體；多態(tài)性,單核苷酸；突發(fā)性耳聾；疾病易感性

突發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾又稱為突發(fā)性耳聾或特發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾，是指在幾個(gè)小時(shí)至3 d之內(nèi)發(fā)生的連續(xù)3個(gè)聽(tīng)覺(jué)頻率存在至少30 dB[1]的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失。全世界大約每年有15 000例[2]突發(fā)性耳聾新發(fā)病例，占突發(fā)性耳聾患者的1%。人類質(zhì)膜Ca2+-ATP酶異構(gòu)體2(PMCA2)基因定位于3號(hào)染色體，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)眾多，但大多數(shù)位于未轉(zhuǎn)錄區(qū)和內(nèi)含子上，在翻譯區(qū)有 8個(gè)位點(diǎn)存在無(wú)義突變，無(wú)錯(cuò)義突變，這些基因位點(diǎn)的多態(tài)性及其與突發(fā)性耳聾的相關(guān)性，將成為突發(fā)性耳聾病因?qū)W研究的重要手段[3]。因此，本研究將選擇PMCA2基因上rs2289274和rs6790640兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)，其中rs2289274位點(diǎn)存在A/G多態(tài)性，對(duì)應(yīng)的編碼產(chǎn)物為434位的天冬氨酸， rs6790640位點(diǎn)存在C/T多態(tài)性，對(duì)應(yīng)的編碼產(chǎn)物為1 185位的絲氨酸，本研究將探討這兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，核基因突變是耳聾的可能機(jī)制之一?？赡苌婕暗幕虬≒MCA2、熱休克蛋白60/70(HSP60/70)基因、鈣粘蛋白23(CDH23)基因、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)和T1(GSTT1)基因、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因、血小板糖蛋白受體Ⅰα基因(GPⅠα)等[4-5]。對(duì)于核基因的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系，國(guó)外的研究涉及GSTM1/GSTT1、MTHFR和GPⅠα基因等。研究表明，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GSTs)是人體內(nèi)一類具有解毒和抗氧化作用的重要酶類，可催化谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合和運(yùn)輸，在抗氧化細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，但GSTM1和GSTT1的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾不具相關(guān)性[6-7]。而MTHFR作為與甲硫氨酸代謝和葉酸活化形式相關(guān)的同型半胱氨酸的3種酶成分之一，研究已證實(shí)其C677T和A1298C位點(diǎn)的突變可引起內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌和細(xì)胞外基質(zhì)的功能障礙[8-9]；GPⅠa C807T的點(diǎn)突變可引起動(dòng)脈血栓形成，上述二者都可引起耳蝸缺血性損害，造成耳聾[10-11]；而目前，核基因的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的關(guān)系研究，在國(guó)內(nèi)還處于空白。

1資料與方法

1.1一般資料突發(fā)性耳聾患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：幾小時(shí)至3 d內(nèi)發(fā)生的連續(xù)3個(gè)頻率上存在至少30 dB的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，排除糖尿病、中風(fēng)、心血管疾病、雌激素應(yīng)用、眩暈、病毒感染、耳聾家族史、自身免疫性疾病和代謝性疾病等，所有患者進(jìn)行純音測(cè)聽(tīng)(包括125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 Hz，ISO標(biāo)準(zhǔn))、聲阻抗、言語(yǔ)識(shí)別率測(cè)試、聽(tīng)覺(jué)腦干測(cè)聽(tīng)、眼震電圖、頭顱和內(nèi)聽(tīng)道核磁共振等檢查。聽(tīng)力正常組的納入標(biāo)準(zhǔn)：排除糖尿病、中風(fēng)、心血管疾病、雌激素應(yīng)用、眩暈、病毒感染、耳聾家族史、自身免疫性疾病和代謝性疾病等的聽(tīng)力正常的其他患者，涉及病種包括鼻中隔偏曲、鼻息肉、聲帶息肉、慢性扁桃體炎、阻塞性呼吸暫停-低通氣綜合征、耳前瘺管、耳廓瘢痕等。按聽(tīng)力學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，164名患者被分為兩組：突發(fā)性耳聾組82名，聽(tīng)力正常組82名。兩組患者一般資料情況見(jiàn)表1。

表1　　突發(fā)性耳聾與聽(tīng)力正常組患者一般情況比較

a：兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；b：雙側(cè)χ2檢驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1DNA提取采集肘靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，按照DNA提取試劑盒提供的方法提取基因組DNA，在-20 ℃保存。

1.2.2基因分型 采用PCR和等位基因特異擴(kuò)增法分析PMCA2基因上rs2289274和rs6790640兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性。引物設(shè)計(jì)采用Prime Primier5軟件。擴(kuò)增rs2289274引物序列：上游引物5′-GGT CAG CGT GCC TGT CTT-3′，下游引物5′-GGT GGC TCT GCC TTA TTT ACT-3′;PCR擴(kuò)增204 bp的目的片段條件：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增rs6790640引物序列：上游引物5′-GCT GTG GAT GGG GCT CCC TGG ACT C-3′，下游引物5′-CAT TGA TGA CAC CGA CCT G-3′;PCR擴(kuò)增169 bp的目的片段條件：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，通過(guò)紫外線成像系統(tǒng)進(jìn)行區(qū)別。

2結(jié)果

在突發(fā)性耳聾組中rs2289274位點(diǎn)基因頻率分別為AA 55.8%，AG 17.4%，GG 26.8%，等位基因頻率是A 64.5%和G 35.5%。在聽(tīng)力正常組中，rs2289274位點(diǎn)基因型頻率分別為AA 26.8%，AG 28.0%，GG 45.2%，等位基因頻率是A 41.1%和G 58.9%；在突發(fā)性耳聾組中rs6790640位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 18.3%，CT 35.4%，TT 46.3%，等位基因頻率是C 36.3%和T 63.7%。在聽(tīng)力正常組中，rs6790640位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 2.4%，CT 63.4%，TT 34.1%，等位基因頻率是C 34.1%和T 65.9%。兩位點(diǎn)的基因型分布及其等位基因頻率在突發(fā)性耳聾組和聽(tīng)力正常組中，基因型分布及其等位基因頻率部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。

表2　　PMCA2-rs2289274位點(diǎn)基因型分布及其等位基因頻率[n(%)]

表3　　PMCA2-rs6790640位點(diǎn)基因型分布及其等位基因頻率[n(%)]

3討論

PMCA2在維持毛細(xì)胞靜纖毛的功能完整性過(guò)程中起重要作用。Zanni等[12]的研究表明，靜纖毛正常功能的實(shí)現(xiàn)需要高鈣環(huán)境，Ca2+的缺乏會(huì)導(dǎo)致靜纖毛排列紊亂，功能障礙。當(dāng)靜纖毛的微環(huán)境-內(nèi)淋巴中的鈣離子濃度降低時(shí)，定位于靜纖毛上的質(zhì)膜PMCA2能夠在ATP的作用下將靜纖毛中的鈣離子泵入內(nèi)淋巴，保持微環(huán)境中較高的Ca2+濃度。PMCA2的另一重要作用是清除對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生毒性作用的胞內(nèi)鈣[13]。當(dāng)細(xì)胞受外界有害條件刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)胞靜纖毛周圍Ca2+濃度過(guò)高而對(duì)細(xì)胞造成損傷，PMCA2可將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的Ca2+泵出而起到保護(hù)細(xì)胞的作用[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明， PMCA2基因中一個(gè)高度保守氨基酸位點(diǎn)上的A>G突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物甘氨酸(Gly)被絲氨酸(Ser)替換，在另一個(gè)位點(diǎn)由于兩個(gè)堿基對(duì)的缺失引起的移碼突變導(dǎo)致其所編碼蛋白的長(zhǎng)度縮短。因此基因突變小鼠的毛細(xì)胞靜纖毛和基底側(cè)壁中PMCA2表達(dá)缺失，可通過(guò)影響靜纖毛上的感覺(jué)轉(zhuǎn)換和基底膜神經(jīng)遞質(zhì)的釋放導(dǎo)致耳聾的發(fā)生[15-17]。國(guó)內(nèi)僅楊杪等[18]對(duì)噪聲性耳聾患者PMCA2兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)(rs2289274和rs6790640)的多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)rs2289274位點(diǎn)具有AA、AG、GG的基因型和rs6790640位點(diǎn)具有CC、CT、TT基因型，并發(fā)現(xiàn)噪聲性耳聾PMCA2兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)rs2289274和rs6790640都是陰性結(jié)果[18]。國(guó)內(nèi)外很少有人研究突發(fā)性耳聾的病因，特別是PMCA2兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)rs2289274和rs6790640與突發(fā)性耳聾關(guān)系的研究，所以本研究就突發(fā)性耳聾PMCA2兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)rs2289274和rs6790640進(jìn)行研究，并得到部分陽(yáng)性結(jié)果： rs2289274位點(diǎn)在突發(fā)性耳聾組中基因型頻率分別為AA 55.8%，AG 17.4%，GG 26.8%，等位基因頻率A 64.5%和G 35.5%。在聽(tīng)力正常組中rs2289274位點(diǎn)基因型頻率分別為AA 26.8%，AG 28.0%，GG 45.2%，等位基因頻率A 41.1%和G 58.9%。rs6790640在突發(fā)性耳聾組中，位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 18.3%，CT 35.4%，TT 46.3%，等位基因頻率C 36.3%和T 63.7%。在聽(tīng)力正常組中，rs6790640位點(diǎn)基因型頻率分別為CC 2.4%，CT 63.4%，TT 34.1%，等位基因頻率C 34.1%和T 65.9%。兩位點(diǎn)的基因型分布及其等位基因頻率在突發(fā)性耳聾組和聽(tīng)力正常組中，部分基因型AA，GG，CC，CT分布及其等位基因A，G頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，部分基因型AG，TT分布及其等位基因C，T頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明rs2289274和rs6790640這兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性可能是突發(fā)性耳聾易感因素，外因和內(nèi)因通過(guò)多方面因素共同作用單基因的某一個(gè)或者幾個(gè)位點(diǎn)，使其產(chǎn)生突變，從而影響PMCA2功能，進(jìn)而造成突發(fā)性耳聾的發(fā)生。

由于突發(fā)性耳聾病因不明，其治療一直是臨床上棘手的問(wèn)題。由于國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者已證實(shí)基因突變是耳聾的危險(xiǎn)因素之一，只有找到基因突變的位點(diǎn)和類型，才有可能針對(duì)性的進(jìn)行治療[19]。突發(fā)性耳聾也可能是個(gè)多基因疾病，多個(gè)耳聾相關(guān)基因位點(diǎn)的突變與突發(fā)性耳聾的發(fā)生有關(guān)，除MTHFR和GPⅠa的基因突變可引起突發(fā)性耳聾的發(fā)生外，其他耳聾基因的突變將是突發(fā)性耳聾的潛在病因[20]。本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了PMCA2基因的多態(tài)性與突發(fā)性耳聾的相關(guān)性，將可能找突發(fā)性耳聾的病因，并通過(guò)進(jìn)一步闡述突發(fā)性耳聾的病因機(jī)制，為下一步基因探針的制備和突發(fā)性耳聾基因診斷、治療的開(kāi)展打下基礎(chǔ)。

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Association between poly-morphism of Ca2+-ATPase isomer 2 gene in plasma membrane and sudden deafness*

DengJiahong1,JinLei2△

(1.DepartmentofE·N·T,theFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofE·N·T,Yan′anHospital,Kunming,Yunnan650000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Ca2+-ATPase isomer 2 gene (PMCA2) in plasma membrane and the development of sudden deafness.MethodsTotally,164 patients were investigated and hearing tests were conducted.According to the results of audiometry,they were divided into two groups,sensorineural hearing loss group(n=82) and normal hearing group(n=82).Polymorphisms of two single nucleotide loci rs2289274 and rs6790640 in the PMCA2 gene were determined by polymerase chain reaction followed by allele specific amplication analysis.ResultsIn the sudden deafness group,frequencies of genotypes AA,AG and GG in the rs2289274 locus were 55.8%,17.4% and 26.8% respectively,while frequencies of alleles A and G in the same locus were 64.5% and 35.5% respectively;in the sensorineural hearing loss group,were 26.8%，28.0% and 45.2% respectively,while frequencies of alleles A and G were 41.1% and 58.9%.And,in the sudden deafness group,frequencies of genotypes CC,CT and TT in the rs2289274 locus were18.3%，35.4% and 46.3% respectively,while frequencies of alleles C and T in the same locus were 36.3% and 63.7%;in the normal hearing group,were 2.4%， 63.4% and 34.1% respectively,while frequencies of alleles C and T were34.1% and 65.9%,respectively.Genotypes distribution of two sites and their allele frequencies of the two groups,some differences of them had statistical significance(P<0.05).ConclusionIt is suggested that genetic polymorphism of the rs2289274 and rs6790640 loci in the PMCA2 gene might be a susceptible factor for sudden deafness.

[Key words]calcium-transporting ATPases;PMCA2;polymorphism,single nucleotide;sudden deafness;disease susceptibility

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.019

基金項(xiàng)目：云南省科技廳聯(lián)合專項(xiàng)(CD190)。

作者簡(jiǎn)介：鄧嘉虹(1975-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事耳聾基因相關(guān)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:cou68_deng@sina.com。

[中圖分類號(hào)]R764.437

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0056-03

(收稿日期：2015-03-22修回日期：2015-06-28)