市售洋槐蜜多酚類成分及其抗氧化活性研究

孫春麗+王紫燕+李春陽(yáng)+張紅城

摘要：收集了在全國(guó)范圍內(nèi)銷售的15種洋槐蜜樣品，通過(guò)HPLC-DAD對(duì)蜂蜜樣品多酚類成分進(jìn)行分析，測(cè)定了總酚酸和總黃酮含量，以及蜂蜜清除DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧自由基的能力和還原力。結(jié)果表明，市售洋槐蜜質(zhì)量參差不齊，總酚酸含量從3.7 mg/g到23.3 mg/g；總黃酮含量從2.2 mg/kg到12.9 mg/kg。15種商品洋槐蜜均具有一定的抗氧化活性。此外，在15種商品洋槐蜜中只有4個(gè)種樣品具有蜂蜜來(lái)源純正、成分齊全的特點(diǎn)，是品質(zhì)好的洋槐蜂蜜。

關(guān)鍵詞：洋槐蜜；多酚類成分；抗氧化；黃酮；酚酸；質(zhì)量監(jiān)控依據(jù)

中圖分類號(hào)： S896.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0321-07

蜂蜜是蜜蜂將采集的植物花蜜，混以蜜蜂唾液腺的分泌物，經(jīng)過(guò)充分釀造而貯藏在巢脾內(nèi)的甜物質(zhì)。其中糖類成分占70%以上，水分占16%～25%，蛋白質(zhì)平均含量為 0.16%[1]。蜂蜜不僅是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的保健食品，而且具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、解毒、消炎[2]、抗癌[3]、保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)細(xì)胞再生[4]等。一些研究證明，多酚類物質(zhì)（如酚酸和黃酮）具有強(qiáng)的抗氧化能力[5]。蜂蜜中含有豐富的多酚類成分，這些成分不僅具有很強(qiáng)的抗氧化活性，而且具有多種生物活性。因此本研究收集了市售15種洋槐蜜樣品，對(duì)其中的多酚類成分及其抗氧化活性進(jìn)行分析，為洋槐蜜產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 收集在商場(chǎng)及專賣(mài)店銷售的15種洋槐蜜樣品，品牌種類用A、B、C、…、O代替，其詳細(xì)信息如表1所示。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 4-二羥基苯甲醛酸，香草酸，咖啡酸，p-香豆酸，阿魏酸，異阿魏酸，苯甲酸，3，4-二甲氧基肉桂酸，肉桂酸，脫落酸，咖啡酸苯乙酯，短葉松素，山奈酚，山姜素，松屬素，柯因，高良姜素，蕓香苷，來(lái)自Sigma 公司；咖啡酸芐酯來(lái)自 Funakoshi 公司；短葉松素-3-乙酸酯來(lái)自BioBioPha公司；5-甲氧基短葉松素是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從蜂膠中收集獲得。1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacids）（ABTS），6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid（Trolox），熒光素鈉（sodium fluorescein），2，2，-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride （ABAP），來(lái)自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 LC-6AD高效液相色譜儀[配有二極管陣列紫外檢測(cè)器（PDA）、SIL-自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10A柱溫箱、LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]，日本島津公司生產(chǎn)；SynergyTM HT型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-tek公司生產(chǎn)；24孔固相萃取裝置，美國(guó)Supelco公司生產(chǎn)；固相萃取小柱Strata-X-A （60 mg/3 mL），美國(guó)菲羅門(mén)公司生產(chǎn)；恒溫水浴氮吹儀，北京科林工貿(mào)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜中多酚類成分的提取[6] 準(zhǔn)確稱取20 g洋槐蜜樣品，蒸餾水5倍稀釋，玻璃棒攪拌至蜂蜜完全溶解。8 000×g離心10 min除去固體不溶物，取上清液倒入提前處理好的Strata-X-A固相小柱。上樣結(jié)束后，用3 mL超純水（pH值7）清洗，后用5 mL甲酸-甲醇（5 ∶95，V/V）溶解洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在45 ℃恒溫水浴氮吹儀中干燥，用 2 mL 色譜級(jí)乙酸甲醇（2 ∶98，V/V）溶解。

1.2.2 蜂蜜提取物中總酚酸含量的測(cè)定[7] 采用Folin-Ciocalteu法，以沒(méi)食子酸作為對(duì)照建立總酚酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取150 μL蜂蜜提取液，以沒(méi)食子酸相對(duì)含量表示。

1.2.3 蜂蜜提取物中總黃酮含量的測(cè)定[7] 采用AICI3 法，以蕓香苷作為對(duì)照建立總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取1 mL蜂蜜提取物溶液，以蕓香苷的相對(duì)含量表示。

1.2.4 ABTS+自由基清除能力測(cè)定[8] 吸取200 μL不同濃度Trolox，加入3 mL ABTS+溶液，震蕩30 s，靜置6 min后，在734 nm處測(cè)定吸光度。蜂蜜樣品稀釋為不同濃度，測(cè)定方法與Trolox一致。清除率按照如下公式計(jì)算：ABTS+自由基清除率=（D0-D）/D0×100%。式中：D0表示空白試劑吸光度，D表示樣品溶液吸光度。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定[9] 取1 mL不同濃度的蜂蜜溶液，加入4 mL 0.2 mol/L DPPH乙醇溶液，避光靜置 30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同蜂蜜樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率=（D0-D）/D0×100%。式中：D0表示空白試劑吸光度，D表示樣品溶液吸光度。

1.2.6 還原力測(cè)定[10] 取200 μL稀釋成不同濃度的蜂蜜溶液，依次加入0.2 mol/L、pH值6.6 磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀2.5 mL，50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸 1 mL，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水5 mL，0.1% 三氯化鐵 0.5 mL 混勻，在700 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.7 過(guò)氧陰離子清除能力（ORAC法）[11] 吸取20 μL的稀釋后的樣品液至96孔板，加入150 μL 0.081 6 μmol/L熒光素（FL）溶液，覆膜，37 ℃孵育10 min。加入30 μL 153 mmol/L ABAP啟動(dòng)反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm，每分鐘測(cè)定1次，測(cè)定50 min。ORAC值采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部的單位，即μmol Trolox當(dāng)量/100 g 樣品?？寡趸芰Γ╝ntioxidant capacity）=AUCantioxidant-AUCblank。面積差代入Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線即得Trolox當(dāng)量。

1.2.8 HPLC色譜條件 HPLC條件為Shim-Pack PREP-ODS （250×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫箱溫度35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：B相為甲醇（2% 乙酸），A相為水（2% 乙酸）；梯度洗脫程序如下：0～30 min，9%～12% B；30～80 min，22%～40% B；80～130 min，40%～ 65% B；130～150 min，65%～80% B；流速為0.7 mL/min。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 使用SAS 9.1軟件，鄧肯法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[12]。采用克拉默（Kramer）檢驗(yàn)法來(lái)評(píng)價(jià)蜂蜜的綜合抗氧化能力[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 15種蜂蜜總酚酸和總黃酮含量的測(cè)定

國(guó)內(nèi)外對(duì)于蜂蜜的化學(xué)組成研究報(bào)道較多[14]，主要是針對(duì)不同種類的單花蜜，而對(duì)于目前市售蜂蜜研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)選取15種市售洋槐蜜作為試驗(yàn)材料，對(duì)其總酚酸、總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，從表2中可以看出，各品牌的洋槐蜜總酚酸和總黃酮含量具有一定的差異。品牌F的酚酸含量最低僅為3.7 mg/kg，品牌J酚酸含量最高為23.3 mg/kg，約是品牌F的7倍。根據(jù)酚酸含量之間的差異性可以將15個(gè)樣品分為3組，第1組酚酸含量均大于14.0 mg/kg，主要包括樣品B、E、J、K、L；第2組酚酸含量范圍為11.1～ 14.0 mg/kg，主要包括樣品A、C、H、M；第3組酚酸含量偏低，均小于 10.0 mg/kg，包括樣品D、F、G、I、N、O。

此外，不同品牌洋槐蜜黃酮含量也表現(xiàn)出顯著的差異。品牌F含量?jī)H為2.2 mg/kg，品牌J黃酮含量為 12.9 mg/kg，約為品牌F的6倍。根據(jù)黃酮含量之間的差異性，將15個(gè)樣品分為3組，第1組黃酮含量均大于 7.0 mg/kg，主要包括A、B、C、J、K、L；第2組黃酮含量范圍為5.0～7.0 mg/kg，包括D、E、G、M、N；第3組黃酮含量偏低，均小于5.0 mg/kg，包括F、H、I、O。除去樣品C、D、G、N，各樣品黃酮含量與酚酸含量之間都具有一定的相關(guān)性，且不同組別之間差異顯著（P<0.05）。這說(shuō)明同一樣品蜂蜜總酚酸和總黃酮含量之間具有一定的正相關(guān)關(guān)系，但是同一品種的蜂蜜總酚酸和總黃酮含量因地域不同存在一定的區(qū)別。

2.2 15種蜂蜜抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力 Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，以不同濃度樣品清除ABTS+自由基的能力計(jì)算IC50，由試驗(yàn)結(jié)果可知，清除率隨著濃度升高而增加，從15種蜂蜜清除ABTS+自由基IC50值（表2）可以看出樣品G清除ABTS+自由基能力最強(qiáng)，IC50值為（349.48 ± 51.31） mg/mL，樣品B的IC50值為（1 018.81 ± 15.96） mg/mL，是15種洋槐蜜中清除ABTS+自由基能力最弱的，兩者相差2倍。15個(gè)品牌洋槐蜜清除ABTS+自由基能力由大到小依次為G>O>D>F>A>J>N>I>K>L>H>M>E>C>B。

2.2.2 DPPH 自由基清除能力 由表2可知，15種樣品對(duì)DPPH自由基均具有不同程度的清除能力?？偡铀岷涂傸S酮含量較高的J樣品和D樣品具有較高的清除自由基的能力，IC50值分別為（336.67 ± 3.64）、（366.44 ± 27.92） mg/mL；樣品H清除自由基的能力最弱，IC50值為 975.72 mg/mL。這表明同一品種蜂蜜地域不同，抗氧化能力也存在差異。

2.2.3 還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定是評(píng)價(jià)樣品是否具有良好的電子供應(yīng)能力，還原力強(qiáng)的樣品為良好的電子供應(yīng)者，同時(shí)還原力越強(qiáng)，表示抗氧化性越強(qiáng)[15]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，15種洋槐蜜均具有還原力，可作為電子供應(yīng)者，與自由基反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的物質(zhì)。

由表2可得，品牌J的還原能力最強(qiáng)，每100 g 蜂蜜相當(dāng)于（73.28±2.80） mg Trolox；品牌N還原力最弱，每100 g蜂蜜僅相當(dāng)于（35.96±1.70） mg Trolox，僅為品牌C的49%。15個(gè)品牌洋槐蜜還原力存在一定的差異。15個(gè)品牌洋槐蜜還原力由大到小依次為J>C>E>F>K>A>L>M>D>B>G>I>O>H>N。

2.2.4 過(guò)氧陰離子清除能力（ORAC法） 氧化自由基吸收能力測(cè)定法 （oxygen radical absorbance capacity，ORAC），與其他抗氧化能力分析方法相比，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。美國(guó)農(nóng)業(yè)部2007年、2010年公布的一系列食品的抗氧化能力都是采用ORAC法測(cè)定的[16-17]。由表2可知，不同品牌洋槐蜜都有明顯的抗氧化性。其中樣品J抗氧化能力最強(qiáng)，ORAC值為 57.67 μmol Trolox/100 g，且與其他各品牌ORAC數(shù)值之間差異顯著（P<0.05）；品牌I的抗氧化性最弱，ORAC值為 23.75 μmol Trolox/100 g，與其他品牌之間也差異顯著（P<005）。品牌A、E、F、J、K具有相對(duì)較強(qiáng)的抗氧化性，ORAC值均大于45.00 μmol Trolox/100 g，且這5個(gè)品牌之間差異顯著（P<0.05）。

2.2.5 15種洋槐蜜綜合抗氧化性能 綜合上述4種抗氧化能力，采用克拉默（Kramer）檢驗(yàn)法[13]，對(duì)15種不同品牌洋槐蜜的綜合抗氧化性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。查克拉默順序檢驗(yàn)表：n=4，m=15，上段數(shù)據(jù)a～b=10～54，因?yàn)閙ax Qi=54，min Qi=10，所以對(duì)置信度α=5%，15種洋槐蜜之間差異不顯著。

查克拉默順序檢驗(yàn)表：n=4，m=15，下段數(shù)據(jù)c～d= 18～46，對(duì)于品牌J和品牌K，Qi=10，17 < 18，所以對(duì)置信度α=5%，品牌J、K與其他品牌洋槐蜜之間差異顯著；品牌H、I的Qi > 46，所以對(duì)置信度α=5%，品牌H、I與其他品牌洋槐蜜之間差異顯著。

這說(shuō)明品牌J、K洋槐蜜綜合抗氧化性能最強(qiáng)，品牌H、I洋槐蜜綜合抗氧化性能最弱。15種洋槐蜜綜合抗氧化性能由大到小依次為J>K>A>F>E>L>G>M>C>N>D>O>B>H>I。

2.3 15種蜂蜜提取物中多酚類成分

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)不同品牌蜂蜜提取物的成分進(jìn)行定性定量分析，標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果見(jiàn)圖1。

根據(jù)不同品牌洋槐蜜中多酚類成分種類以及特征性成分含量，可以將15個(gè)蜂蜜樣品分為3組。第1組樣品多酚類成分齊全，含有9～16個(gè)活性成分，包括A、B、C、D 4個(gè)品牌（表4、圖2）。該組樣品提取物中主要包括咖啡酸、p-香豆酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、脫落酸和丁香酸甲酯等成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，脫落酸因其在洋槐蜜中廣泛存在而可以作為原料洋槐蜜的標(biāo)志性成分[18-20]。此外，高含量的丁香酸甲酯被認(rèn)為是油菜蜜的典型特征[21]。根據(jù)該組樣品中丁香酸甲酯與脫落酸含量的比值小于0.5的特征，以及與原料洋槐蜜中多酚類成分的比較[22-23]等，可以斷定該組樣品洋槐蜜來(lái)源純正、純度好、品質(zhì)高，初步認(rèn)為是品質(zhì)好的洋槐蜜。

第2組中包括E、F、G、H、I 5個(gè)品牌，含有10～17個(gè)多酚類成分，該組樣品丁香酸甲酯與脫落酸的含量比值相對(duì)第1牌洋槐蜜中該成分峰值低（圖3）。綜上所述，該組洋槐蜜產(chǎn)品多酚類化合物種類齊全，丁香酸甲酯與脫落酸含量比值相對(duì)第1組有稍微升高，因此，這5個(gè)品牌的樣品屬于一般品質(zhì)洋槐蜜。

第3組樣品包含J、K、L、M、N、O 6個(gè)品牌，多酚類成分種類存在一定差異，例如品牌L中鑒定出14種多酚類成分，而品牌O中僅鑒定出4種成分。丁香酸甲酯含量對(duì)比前2組樣品明顯升高，平均含量為2 726.0 μg/kg，是第1組樣品平均含量的7倍。此外，脫落酸平均含量也僅為第1組含量的1/3，品牌O中未鑒定到脫落酸（表4、圖4）。除去品牌O，該組丁香酸甲酯與脫落酸的含量比值范圍為2.47～131.91。

J、K、L、M中多酚類成分與原料蜜[19-20，23]相比，種類差距不大，主要含有香草酸、咖啡酸、p-香豆酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、脫落酸和丁香酸甲酯。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，脫落酸是洋槐蜜的標(biāo)志性成分[18-20]，丁香酸甲酯是油菜蜜的典型特征[21]，這4個(gè)樣品脫落酸含量低，丁香酸甲酯含量高，兩者比值范圍為2.47～7.42，因此推斷這些洋槐蜜樣品可能是添加油菜蜜。此外，樣品N、O中分別僅鑒定出4種和6種化合物，且品牌N中丁香酸甲酯與脫落酸含量比值高達(dá)131.9，因此可推斷其原料蜜可能是油菜蜜為主的蜂蜜。

3 結(jié)論

根據(jù)克拉默（Kramer）檢驗(yàn)法，15種商品洋槐蜜中，品牌J和K綜合抗氧化性能最強(qiáng)，品牌H和I綜合抗氧化性能最弱。15種洋槐蜜綜合抗氧化性能由大到小依次為J>K>A>F>E>L>G>M>C>N>D>O>B>H>I。通過(guò)HPLC-DAD對(duì)其多酚類成分分析表明，15種商品洋槐蜜中只有4個(gè)品牌樣品具有蜂蜜來(lái)源純正、成分齊全特點(diǎn)，是高品質(zhì)蜂蜜；有5個(gè)品牌屬于中等品質(zhì)洋槐蜜；另外有6個(gè)樣品可能添加了油菜蜜。

總之，按照多種方法綜合鑒定蜂蜜方法，根據(jù)原料蜜中主要多酚類成分的組成比值范圍，可以更好地評(píng)價(jià)蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量，控制蜂蜜產(chǎn)品中有效成分，保持其質(zhì)量穩(wěn)定，維護(hù)了消費(fèi)者的利益。

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