鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞DNA損傷的比較研究

何蕾+王璐+惠秀娟+劉宛+宋婕+徐成斌+王鶴潼

摘要：通過彗星試驗比較研究了鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的DNA損傷。設(shè)置6個不同劑量組（陰性對照組、7.5、15、30、60、120 mg/kg組）對小鼠進(jìn)行30 h 灌胃方式染毒，末次染毒 6 h 后小鼠頸椎脫臼處死。檢測小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星細(xì)胞率、彗星尾長及尾矩。結(jié)果表明：（1）鹽酸小檗堿可引起上述3種受試器官的DNA損傷，且隨劑量增加，DNA損傷增加（P<0.05），呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。（2）比較同劑量組不同器官之間的彗星細(xì)胞率、彗星尾長及彗星尾矩，3個劑量組均為腎細(xì)胞>脾細(xì)胞>肝細(xì)胞，并存在器官間顯著差異（P<0.05）。一定劑量鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞造成了DNA損傷，具有一定的遺傳毒性，比較研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞對鹽酸小檗堿致DNA損傷最為敏感。

關(guān)鍵詞：鹽酸小檗堿；DNA損傷；彗星試驗；小鼠

中圖分類號： X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0305-03

鹽酸小檗堿又稱黃連素，是苯并異喹啉類銨型生物堿[1]，以清熱解毒和抗菌等療效著稱，在臨床上作為廣譜抗菌類藥物已使用多年。鹽酸小檗堿還具有降血糖、抗心律失常、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[2-3]。鹽酸小檗堿也表現(xiàn)出一定的毒副作用，研究表明大鼠大腦中遺傳物質(zhì)的合成、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞呼吸鏈相關(guān)酶的正常運轉(zhuǎn)、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元死亡、小腦顆粒神經(jīng)元死亡，這些都受到侵入細(xì)胞內(nèi)的鹽酸小檗堿的影響[4]。鹽酸小檗堿還被大劑量地添加在動物飼料中，由于過量使用不能被完全吸收代謝，大部分仍會以原藥或次級代謝產(chǎn)物的形式隨動物糞便排泄出體外，污染地下水及環(huán)境，對于人類以及整個環(huán)境都造成巨大的危害。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（SCGE），又稱彗星試驗，SCGE在1984年首次由Ostling等[5]提出，是一種在細(xì)胞層面上準(zhǔn)確檢測DNA損傷的方法，應(yīng)用于很多領(lǐng)域[6]。Guengerich等[7]應(yīng)用彗星試驗探究了常見和不常見的細(xì)胞色素P450代謝和毒性的相關(guān)化學(xué)反應(yīng)；Knut等[8]通過彗星試驗檢測了紫外線引起的DNA損傷，近幾年，Kliemann等[9]，Djelic等[10]應(yīng)用SCGE技術(shù)探究了人類和動物細(xì)胞的DNA損傷。但目前為止，利用彗星試驗比較鹽酸小檗堿對不同器官DNA損傷差異的研究尚未見報道。因此，為了研究大劑量鹽酸小檗堿的遺傳毒性及其潛在的環(huán)境影響，本研究從細(xì)胞和分子水平上，探究鹽酸小檗堿對于小鼠不同器官的遺傳毒性。通過彗星試驗檢測鹽酸小檗堿誘發(fā)小鼠不同器官彗星細(xì)胞率、彗星尾長及彗星尾矩的變化情況，為進(jìn)一步探究鹽酸小檗堿的遺傳毒性、毒性機(jī)理等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理

采用ICR雄性小鼠（沈陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心）36只，體質(zhì)量25～30 g，使用SAS隨機(jī)程序?qū)嶒瀯游锓譃?組：陰性對照組、7.5、15、30、60、120 mg/kg組。灌胃方式采用30 h灌胃法，末次染毒 6 h 后小鼠頸椎脫臼處死。所有處理均重復(fù) 6次。

1.2 主要試驗試劑

鹽酸小檗堿（分析純）、溴化乙錠 （EB）、過氧化氫（H2O2）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽有限公司；正常熔點瓊脂糖（NMA）、低熔點瓊脂糖（LMA）、二甲亞砜（DM-SO）、及硫代巴比妥酸等購自美國 Sigma 公司，試劑均為優(yōu)級純。

1.3 試驗步驟

參照Singh 等改進(jìn)和建立的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)[11]，并進(jìn)行改良。

1.3.1 細(xì)胞懸液的制備 試驗小鼠常規(guī)喂養(yǎng)2周后，稱質(zhì)量，頸椎脫臼處死取出肝臟、脾和腎臟，用4 ℃的磷酸緩沖液（PBS）沖洗浮血，濾紙粘去表面液體后稱質(zhì)量、計數(shù)。將上述組織剪成糜狀，加適量冰冷的PBS溶液，壓濾后通過200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，用D-Hanks溶液調(diào)整，使細(xì)胞濃度保持106～107個/mL，于4 ℃保存待用。

1.3.2 染毒 參照鹽酸小檗堿對小鼠的急性經(jīng)口LD50為763.5 mg/kg，設(shè)定鹽酸小檗堿染毒劑量組：7.5、15、30 mg/kg。

1.3.3 制膠片 分3 層：底層為正常熔點瓊脂糖層，中間層為含細(xì)胞懸液的低熔點瓊脂糖層，第3 層為低熔點瓊脂糖凝膠層。其中每個試驗劑量組制作3張膠片作為平行樣。

1.3.4 細(xì)胞裂解 取出制好的膠片移去蓋玻片，將載玻片橫向浸入新配制的4 ℃細(xì)胞裂解液1.5 h。裂解結(jié)束后用4 ℃PBS緩沖溶液進(jìn)行漂洗。

1.3.5 DNA堿解旋 將載玻片按首尾相連的順序浸入新配制的堿性電泳緩沖液，液體沒過所有載玻片250 mm，15 ℃條件下，避光解旋40 min。

1.3.6 電泳 恒定電壓25 V、電流300 mA，避光電泳20 min。

1.3.7 中和 將載物片淹沒于Tris-HCl （pH值=75） 15 min。

1.3.8 染色與觀察 避光條件下，50 μL EB染色15 min，放置于倒置式熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。用515～560 nm 的激發(fā)光觀察，每個樣本在200倍下隨機(jī)選擇50 個彗星圖像，用 CASP（Comet Assay Software Project）圖像分析軟件測量尾長和尾矩。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用 Excel 2007軟件整理試驗數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗和方差分析，計算彗星試驗彗星細(xì)胞率、尾長、尾矩的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時進(jìn)行Tukey HSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星細(xì)胞率

彗星試驗檢測鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星細(xì)胞率的結(jié)果見表1。由表1可知，小鼠肝、脾、腎3種細(xì)胞所有劑量組同陰性對照組比較，其彗星細(xì)胞率顯著增加（P<005）。3種細(xì)胞劑量組的彗星細(xì)胞率依次是陰性對照組的5.2～20.3、6.8～9.1、9.2～11倍，說明鹽酸小檗堿對小鼠的肝、脾、腎細(xì)胞均造成了DNA損傷，且損傷程度隨劑量組變化。

2.2 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星尾長

彗星試驗檢測鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星尾長影響的結(jié)果見圖1。當(dāng)鹽酸小檗堿染毒劑量為15 mg/kg時，小鼠各器官彗星尾長即顯著性增加（P<0.05），且隨著濃度的增加，受試器官尾長均呈現(xiàn)不同程度加大，DNA 損傷加劇，說明鹽酸小檗堿對小鼠的肝、脾、腎細(xì)胞均造成了DNA損傷，且隨著鹽酸小檗堿劑量的增加，小鼠肝、脾、腎3種器官彗星尾長都加大，呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的彗星尾矩

圖2顯示了不同濃度鹽酸小檗堿染毒后小鼠彗星尾矩的影響。尾矩（tail moment）[12]為尾部中遺傳物質(zhì)DNA所占的含量百分比與尾長數(shù)據(jù)相乘得到的結(jié)果，可以更全面、準(zhǔn)確考察DNA損傷程度。由圖2可知，鹽酸小檗堿在3個染毒劑量作用下，均對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞有一定的DNA損傷。在最小劑量7.5 mg/kg時，小鼠各器官細(xì)胞尾矩與陰性對照組相比有顯著差異（P<0.05）。且隨鹽酸小檗堿濃度的增高，小鼠細(xì)胞DNA損傷程度逐漸增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時，通過試驗前細(xì)胞活性的檢測可知，在沒染毒之前，腎臟細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和脾細(xì)胞的存活率均在95%以上，染毒后細(xì)胞存活率也達(dá)到90%以上，屬于可以使用范疇，說明DNA損傷為鹽酸小檗堿與陽性對照組作用所致，而非細(xì)胞毒性造成細(xì)胞失活引起的損傷。

3 討論

彗星試驗?zāi)軌蛴行y定各種不同類型細(xì)胞的DNA損傷，國際上通常使用彗星尾部DNA含量、彗星尾長和彗星尾矩等指標(biāo)來評價細(xì)胞的DNA損傷[6，13-14]。在遺傳毒理學(xué)、放射生物學(xué)、腫瘤疾病治療等眾多領(lǐng)域，彗星試驗都得到了廣泛應(yīng)用[15-16，5]。本研究檢測了不同劑量鹽酸小檗堿處理后小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的尾長、尾矩以及彗星細(xì)胞率。試驗結(jié)果表明，鹽酸小檗堿可引起受試器官（肝、脾、腎）的DNA損傷，且有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。高賽燕等應(yīng)用彗星試驗檢測溴蟲腈農(nóng)藥的普通制劑、納米制劑、納米功能化制劑對小鼠淋巴細(xì)胞的DNA損傷，發(fā)現(xiàn)溴蟲腈制劑處理組DNA損傷的指標(biāo)與對照組之間差異顯著（P<0.05）[17]。王璐等研究表明鹽酸小檗堿濃度增加，小鼠脾細(xì)胞尾長、尾矩以及彗星細(xì)胞率等指標(biāo)顯著增加，DNA損傷加劇[18]。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是：伴隨染毒劑量增大，DNA損傷加劇，雙螺旋結(jié)構(gòu)逐漸不穩(wěn)定并開始斷裂，小片段越來越多，指示尾部DNA含量和尾長等指標(biāo)變化。但對于鹽酸小檗堿長期染毒條件下小鼠小鼠肝、脾、腎細(xì)胞尾長、尾矩以及彗星細(xì)胞率的變化情況還需要進(jìn)一步探究，相關(guān)的試驗正在進(jìn)行中。

鹽酸小檗堿對不同臟器引起的DNA損傷程度不同：當(dāng)鹽酸小檗堿為最小染毒劑量7.5 mg/kg時，全部受試器官尾長、尾矩以及彗星細(xì)胞率均比對照組顯著增加（P<0.05），尤其是腎細(xì)胞增加更為顯著，各臟器DNA損傷程度，從大至小的順序：腎細(xì)胞>脾細(xì)胞>肝細(xì)胞。這一結(jié)果與Hosseinzadeh等的結(jié)果[19]一致。據(jù)此認(rèn)為腎是最敏感的器官，脾細(xì)胞次之，肝細(xì)胞受損最輕。由于腎臟本身特殊的生理結(jié)構(gòu)和功能，使其成為藥物不良作用的主要靶器官[20]，原因如下：（1）腎臟血流量大，內(nèi)部毛細(xì)血管網(wǎng)豐富，進(jìn)入腎臟的藥量大且接觸面積大。（2）腎髓質(zhì)大量耗氧導(dǎo)致其對腎毒性高度敏感。同時，腎髓質(zhì)的滲透梯度可濃縮尿液，使得藥物及其代謝產(chǎn)物濃度增加，損傷顯著加大。（3）腎臟內(nèi)的部分酶類可將藥物代謝為毒性物質(zhì)；腎臟的酸化功能也容易導(dǎo)致藥物沉淀析出[21]。

綜上所述，研究鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞DNA損傷影響的彗星試驗中，彗星細(xì)胞率、尾長和尾矩3個指標(biāo)表現(xiàn)出良好的關(guān)聯(lián)性，能夠有效地證明鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細(xì)胞的DNA損傷，同時得知腎細(xì)胞對鹽酸小檗堿致DNA損傷最為敏感。本試驗結(jié)果為鹽酸小檗堿遺傳毒性的進(jìn)一步研究以及后續(xù)機(jī)理研究提供了相關(guān)依據(jù)。

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