孫梅+張維娜+高亮+陳秋紅+施大林+匡群+鄒益東+張憲中

摘要：為了篩選1株對水產(chǎn)病原菌具有拮抗作用的菌株，對菌株JSSW-LA進(jìn)行生理生化鑒定、16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用體外抑菌試驗(yàn)、共培養(yǎng)試驗(yàn)考察菌株JSSW-LA對多種水產(chǎn)病原菌的拮抗作用。經(jīng)鑒定表明，菌株JSSW-LA為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），JSSW-LA對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、愛德華氏菌（Edwardsiella）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌抑制效果顯著。共培養(yǎng)結(jié)果顯示，低起始濃度的JSSW-LA（2.8×103 CFU/mL）能夠顯著抑制溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌生長，高起始濃度的JSSW-LA（2.8×106 CFU/mL）對5種致病菌均具有一定的抑制作用。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對水產(chǎn)中的常見致病菌具有較好的抑制作用，是1株拮抗性能優(yōu)良的微生物菌株，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；分離；鑒定；病原菌；拮抗

中圖分類號： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0275-04

近年來，隨著高密度集約化養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，過度提高養(yǎng)殖高密度和過量投餌的養(yǎng)殖方式使養(yǎng)殖動物排泄物、腐爛的殘餌及其他生物殘?bào)w大量沉積，氮、磷等富營養(yǎng)因子排入水體，加重了養(yǎng)殖自身污染，使有害藻類及病菌大量繁殖，養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境日益惡化，并且極大地增加了水產(chǎn)動物之間病原體交叉感染的機(jī)會。為此，各類魚病多發(fā)，甚至造成水產(chǎn)動物大面積的死亡，這不僅降低了水產(chǎn)品的質(zhì)量，而且給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)魚病防治方法是施用藥物，但是此方法容易產(chǎn)生藥物殘留、耐藥性提高等缺點(diǎn)；并且疫苗因針對性強(qiáng)、操作不便等原因，無法大規(guī)模使用；抗生素使用不當(dāng)也容易導(dǎo)致養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)生耐藥性，污染環(huán)境，所以限制其使用。益生素（prodiotics）是近年來國內(nèi)外迅速崛起的一類微生態(tài)制劑，因其具有調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡、提高機(jī)體健康水平、避免服用抗生素帶來的耐藥性和二重感染等問題的優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品、畜牧和水產(chǎn)等行業(yè)[1]。芽孢桿菌是最早應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌，具有穩(wěn)定性高、耐加工、易保存等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，芽孢桿菌被證明具有抗菌活性，能夠產(chǎn)生細(xì)菌素（抗菌肽），可以提高水生動物對養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)能力和抗病能力，其安全、有效的優(yōu)點(diǎn)可逐步替代抗生素的使用[2]。本研究從池塘底泥中分離得到1株編號為JSSW-LA的菌株，通過主要理化特性鑒定、16S rDNA序列測定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建表明，該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究采用體外抑菌試驗(yàn)考察解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA 對水產(chǎn)常見病原菌的抑制作用，同時(shí)利用共培養(yǎng)試驗(yàn)法考察不同濃度的解淀粉芽孢桿菌對病原菌的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源 JSSW-LA菌株分離篩選自無錫市鵝湖青魚池塘底泥。溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、愛德華氏菌（Edwardsiella）、鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心魚病研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離篩選用培養(yǎng)基組成為：10 g/L麩皮，10 g/L 玉米漿干粉，5 g/L NaCl，pH值7.0?；A(chǔ)培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基[3]，組成為：5 g/L葡萄糖，1 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH值7.0。

1.1.3 儀器與試劑 PCR儀：Eppendorf Mastercycler gradient；凝膠成像系統(tǒng)：Molecular lmager ChemiDocTM XRST；移液器：Thermo Finnpipette；低溫離心機(jī)：eppendorf Centrifuge 5810R；電泳儀；高壓滅菌鍋、電子天平、超凈工作臺、振蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱等均為國產(chǎn)品牌。

細(xì)菌生化反應(yīng)管，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司；goldview染料，購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl等，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麩皮、玉米漿干粉，市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌菌株的分離純化 樣品采集于無錫鵝湖青魚池塘，稱取10 g池塘底泥置于裝有90 mL無菌水及少量玻璃珠的250 mL三角瓶中，振蕩30 min，靜置；取上清，接種于分離培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)7 d。

每個(gè)樣品吸取1.0 mL，于80 ℃加熱10 min，用移液槍吸取0.1 mL于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，涂布，37 ℃培養(yǎng)。挑取單菌反復(fù)劃線純化3次，待長出菌落后，隨機(jī)挑選菌落并純化、編號、保存。

1.2.2 篩選菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[4]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]，挑取待檢菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將0.85%生理鹽水稀釋至約109 CFU/mL的菌懸液接入細(xì)菌鑒定生化管，置于37 ℃培養(yǎng)，按照說明書觀察結(jié)果。

1.2.2.2 16S rRNA序列測定 利用細(xì)菌16S rRNA通用引物，其中正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，反向引物1 540 r：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3擴(kuò)增目的基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以分離菌株JSSW-LA的基因組DNA為模板，25 μL PCR反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×buffer（含Mg2+）緩沖液、0.5 μL dNTP、0.2 μL酶、各0.5 μL引物，2 μL DNA模板，加無菌水補(bǔ)足體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。取5 μL產(chǎn)物在含goldview染色劑的1%瓊脂糖凝膠上電泳，條件為150 V、100 mA、20 min。電泳結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)，觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

將菌株JSSW-LA的16S rDNA基因序列與GenBank中已知的核酸序列進(jìn)行Blast分析，挑選同源性較高的序列在Cluster X軟件中完成序列比對，比對結(jié)束后用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 解淀粉芽孢桿菌對病原菌的拮抗作用

1.2.3.1 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA抑菌性測定 紙片法是體外抑菌試驗(yàn)的常用方法之一[6]，它不僅有利于觀察細(xì)菌通過分泌抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的抑菌圈，而且能夠觀測到具有優(yōu)勢拮抗作用的菌株。將無菌濾紙片在濃度約為107 CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA新鮮培養(yǎng)液中浸泡1.0 h。取 01 mL 106 CFU/mL水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見致病菌嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、愛德華氏菌、副溶血性弧菌、鰻利斯頓氏菌的液體培養(yǎng)液，分別涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上，然后將浸泡過菌液的濾紙片貼于培養(yǎng)皿上，每個(gè)平皿貼3片，每個(gè)平皿3次重復(fù)。將平皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，測量抑菌圈大小。

1.2.3.2 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與致病菌共培養(yǎng)試驗(yàn) 選取“1.2.3.1”節(jié)中經(jīng)測定JSSW-LA對其能起到抑制生長作用的致病菌，活化后與解淀粉芽孢桿菌菌液共同接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌起始濃度分別為1×103、1×106 CFU/mL，致病菌起始濃度為1×106 CFU/mL，于30 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h，其間于0、3.5、7.0、140、24.0、38.0、48.0 h取樣計(jì)數(shù)，觀察解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對致病菌的拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化特性

經(jīng)過分離純化，對得到的1株編號為JSSW-LA的菌株進(jìn)行生理生化特征檢測，結(jié)果顯示，該菌株能分解利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、木糖、甘露醇，能水解淀粉和明膠、分解酪素、還原硝酸鹽，分別能在50 ℃、pH值5.7、7%NaCl環(huán)境下生長，主要生理生化特性見表1。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

菌株JSSW-LA基因序列測序結(jié)果表明，16S rRNA 基因長度為1 463 bp，將菌株所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列在 NCBI 通過Blast進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明為芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列，采用鄰接法構(gòu)建的菌株分子發(fā)育樹見圖1，所分離菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（登錄號：KC692189）屬同1支，同源性達(dá)99%以上。結(jié)合生理生化特征，將所分離菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA抑菌性的測定

從表2可看出，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌均具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的抑制效果較顯著，對溶藻弧菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌無明顯抑制作用。

2.4 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與病原菌共培養(yǎng)

2.4.1 解淀粉芽孢桿菌與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng) 由圖2可見，在共培養(yǎng)過程中，起始濃度為2.8×103 CFU/mL的JSSW-LA不能抑制嗜水氣單胞菌的生長；起始濃度為2.8×106 CFU/mL的JSSW-LA在共培養(yǎng)過程中對嗜水氣單胞菌的生長能夠起到一定的抑制作用；單獨(dú)培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌在 48.0 h 內(nèi)菌濃度由1.1×106 CFU/mL上升至7.0×109 CFU/mL，共培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌在48 h內(nèi)菌濃度由 1.1×106 CFU/mL 上升至1.8×109 CFU/mL，菌體量較單獨(dú)培養(yǎng)降低74.3%。因此可知，高起始濃度JSSW-LA對嗜水氣單胞菌的生長具有一定的拮抗作用。

2.4.2 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與愛德華氏菌的共培養(yǎng) 由圖3可見，在JSSW-LA與愛德華氏菌共培養(yǎng)過程中，當(dāng)2個(gè)起始濃度的JSSW-LA進(jìn)入對數(shù)增長期后，愛德華氏菌菌體濃度增長緩慢或逐漸下降，說明2個(gè)起始濃度的JSSW-LA均能在不同程度上抑制愛德華氏菌的生長，試驗(yàn)后期愛德華氏菌菌濃度上升與解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA的活性降低有關(guān)。從試驗(yàn)結(jié)果來看，高起始濃度的JSSW-LA比低起始濃度對愛德華氏菌的抑制效果更好。

2.4.3 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與維氏氣單胞菌的共培養(yǎng) 由圖4可見，起始濃度為2.8×103 CFU/mL 的JSSW-LA在與起始濃度7.8×106 CFU/mL的維氏氣單胞菌共培養(yǎng)過程中無法抑制致病菌的生長，而起始濃度為2.8×106 CFU/mL 的JSSW-LA在共培養(yǎng)過程中對維氏氣單胞菌的生長能夠起到一定的抑制作用。單獨(dú)培養(yǎng)的維氏氣單胞菌在48.0 h內(nèi)菌濃度由7.8×106 CFU/mL上升至1.9×109 CFU/mL，共培養(yǎng)的維氏氣單胞菌在48.0 h內(nèi)菌濃度由7.8×106 CFU/mL上升至4.0×108 CFU/mL，菌體量較單獨(dú)培養(yǎng)降低78.9%。因此可知，高起始濃度的JSSW-LA對維氏氣單胞菌具有較好的拮抗作用。

2.4.4 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與豚鼠氣單胞菌的共培養(yǎng) 由圖5可見，在JSSW-LA與豚鼠氣單胞菌共培養(yǎng)過程中，在7～14 h培養(yǎng)階段，與起始濃度為2.8×106 CFU/mL的JSSW-LA共培養(yǎng)的豚鼠氣單胞菌菌濃度由2.8×108 CFU/mL 降為6.6×103 CFU/mL，起始濃度為2.8×103 CFU/mL JSSW-LA共培養(yǎng)的豚鼠氣單胞菌菌濃度由 8.5×108 CFU/mL 降為7.8×106 CFU/mL。因此可知， 不同起始濃度的JSSW-LA均能不同程度抑制豚鼠氣單胞菌的生長，且高濃度JSSW-LA對豚鼠氣單胞菌的拮抗作用更強(qiáng)；培養(yǎng)至中后期，隨著JSSW-LA活性降低，對豚鼠氣單胞菌的拮抗作用減弱，豚鼠氣單胞菌快速增長。

2.4.5 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與溫和氣單胞菌的共培養(yǎng) 由圖6可看出，JSSW-LA對溫和氣單胞菌的生長具有拮抗作用。單獨(dú)培養(yǎng)的溫和氣單胞菌在48 h內(nèi)菌濃度由 6.6×106 CFU/mL 上升至1.9×109 CFU/mL；而在與解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA的共培養(yǎng)過程中，無論JSSW-LA的起始濃度是2.8×103 CFU/mL還是2.8×106 CFU/mL，溫和氣單胞菌的生長量在JSSW-LA進(jìn)入對數(shù)期后均明顯降低，至48.0 h時(shí)，溫和氣單胞菌的濃度分別為0.3萬、1.1萬CFU/mL，明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)的菌濃度1.9×109 CFU/mL。因此可見，JSSW-LA對溫和氣單胞菌具有很強(qiáng)的拮抗作用。

4 小結(jié)與討論

解淀粉芽孢桿菌是一種好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，與枯草芽孢桿菌具有很高的親緣性。該菌在自然界分布廣泛，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，生長快，穩(wěn)定性好，并且其代謝產(chǎn)物較為豐富，如表面活性肽、伊枯草菌素等[7]，具有廣譜抗菌活性和較強(qiáng)的抗逆能力，對多種病原菌、真菌、有害藻類、線蟲等具有良好的抑制作用，是動植物病害生物防控的有效“武器”。本試驗(yàn)通過對分離篩選得到的菌株JSSW-LA的生理生化測試顯示，該菌株的明膠水解、淀粉水解和硝酸鹽還原均為陽性，能夠利用甘露醇、葡萄糖等，這些都與陳成等分離到的解淀粉芽孢桿菌性質(zhì)[8-9]一致。由于細(xì)菌16S rRNA基因序列具有高度保守性，其核酸片段長度適宜，16S rRNA序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要依據(jù)已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)同[10]。本研究為進(jìn)一步確定菌株的分類學(xué)地位，在細(xì)菌學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上測定了分離菌株16S rRNA序列，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和同源性分析。通過序列比對、發(fā)育樹的構(gòu)建，鑒定JSSW-LA為解淀粉芽孢桿菌。

目前，對拮抗菌的篩選通常采用體外的試驗(yàn)方法，其中紙片法是常用的方法之一。指示菌為致病菌，指標(biāo)是待測菌能夠在瓊脂培養(yǎng)基上對指示菌產(chǎn)生抑制效果[11]。因此，本試驗(yàn)選用紙片法對分離到的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA進(jìn)行7種致病菌體外抑菌試驗(yàn)，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌這5種致病菌具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌抑制效果明顯。

根據(jù)微生物生態(tài)學(xué)原理，將拮抗菌與病原菌共培養(yǎng)，以活菌數(shù)或抑菌圈作為評價(jià)指標(biāo)來篩選候選菌是目前采用較多的方法。目前，針對解淀粉芽孢桿菌對水產(chǎn)常見病原菌拮抗作用方面的研究較少，并且多集中于解淀粉芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌拮抗作用的研究。曹海鵬等從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選了1株優(yōu)良的鱘源嗜水氣單胞菌拮抗菌解淀粉芽孢桿菌G1，其對鱘源嗜水氣單胞菌S1產(chǎn)生的抑菌圈直徑為 18.50 mm[6]。劉亞楠在體外通過對抑菌譜及在共培養(yǎng)條件下對致病性團(tuán)頭魴源嗜水氣單胞菌抑菌效果的測定，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌的S18、S24、F4對嗜水氣單胞菌抑菌效果明顯[12]。本試驗(yàn)分離鑒定得到的JSSW-LA解淀粉芽孢桿菌通過與水產(chǎn)致病菌的共培養(yǎng)，顯示出較強(qiáng)的廣譜抗菌性能，其中低起始濃度的JSSW-LA（2.8×103 CFU/mL）能夠顯著抑制溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的生長，高起始濃度的JSSW-LA（2.8×106 CFU/mL）對5種致病菌均具有一定的抑制作用。共凝集是具有特定遺傳性狀的細(xì)菌之間通過特殊分子黏附起來的過程，是復(fù)雜生物膜發(fā)育的關(guān)鍵機(jī)制，作為一個(gè)特異性較強(qiáng)的過程，共凝集在多樣生物膜系統(tǒng)的發(fā)展和維持中起著重要的生態(tài)學(xué)角色，益生菌與病原菌之間的共凝集被認(rèn)為是排除病原菌的一種方法[13]。JSSW-LA表現(xiàn)出良好

的拮抗性能與其和致病菌具有良好的凝集率有關(guān)，由結(jié)果分析可知，JSSW-LA與溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的凝集率要高于JSSW-LA與嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、愛德華氏菌的凝集率。

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