PPR蛋白APPR6參與ABA調(diào)控擬南芥種子萌發(fā)與幼苗生長

姜上川+梅超+王小芳+張大鵬

摘要：植物激素脫落酸（ABA）參與調(diào)控植物生長發(fā)育各個階段，并在植物對多種脅迫的抗逆反應(yīng)中起著重要作用。PPR基因家族是擬南芥最大的基因家族之一，PPR蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育與響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用，然而參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的線粒體PPR蛋白仍有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥線粒體PPR蛋白APPR6的2個T-DNA插入突變體在萌發(fā)與萌發(fā)后幼苗早期生長過程中對外源ABA超敏，報道APPR6參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為進一步闡明線粒體PPR蛋白的作用機制以及復(fù)雜的ABA信號網(wǎng)絡(luò)提供了新的信息。

關(guān)鍵詞：脫落酸（ABA）；APPR6；PPR蛋白；種子萌發(fā)；幼苗生長；擬南芥

中圖分類號： Q945.3

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0053-05

PPR（pentatricopeptide repeats）蛋白是擬南芥中最大的細胞核編碼的蛋白家族之一，最早在擬南芥基因組序列中發(fā)現(xiàn)[1]。在擬南芥中約有450個PPR蛋白，其他陸生植物基因組序列中可編碼更多[2-3]，并且來自不同種屬的PPR蛋白具有高度同源性。PPR蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征是以35個氨基酸為重復(fù)單位連續(xù)排列，串聯(lián)重復(fù)可達到30次[2]。PPR蛋白在細胞內(nèi)主要分布在線粒體與葉綠體中，在線粒體和葉綠體等細胞器RNA代謝過程中起著重要作用[3]，包括RNA剪接[4-6]、穩(wěn)定[7]、編輯[8-11]、加工[12]以及蛋白質(zhì)翻譯起始和核糖體組裝等[13]。大量研究表明，PPR具有直接結(jié)合RNA功能，通過PPR基序形成的螺旋結(jié)構(gòu)直接結(jié)合RNA，或與其輔助因子共同結(jié)合RNA[2-3]。近年來結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究為進一步闡明PPR蛋白的識別機理與識別密碼奠定基礎(chǔ)[14]。

脫落酸（ABA）是植物體內(nèi)最重要的激素之一，參與調(diào)控植物生長發(fā)育各個階段，并在植物應(yīng)對干旱、滲透、鹽、低溫等非生物脅迫以及病蟲害等生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用[15-16]。定位在線粒體或葉綠體的PPR蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。有的PPR蛋白還與雄性胞質(zhì)不育有密切聯(lián)系[17-18]。目前人們在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個線粒體定位的PPR蛋白參與了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，包括ABO5[4]、SLO2[9]、SLG1[10]、AHG11[11]、PPR40[19]與PGN[20]等，這幾種PPR蛋白通過調(diào)控線粒體中活性氧（ROS）的變化參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。然而在擬南芥龐大的PPR蛋白家族中，仍有更多可能參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的線粒體PPR蛋白有待鑒定。

最近研究發(fā)現(xiàn)擬南芥線粒體PPR蛋白APPR6參與調(diào)控胚胎發(fā)育過程[21]。APPR6（At1g77360）的3個T-DNA插入突變體SALK_045714（appr6-1）、SALK_091917（appr6-2）和SALK_061950（appr6-3）的雜合體中，僅3/4的種子能夠萌發(fā)并且沒有純合體植株；另外1/4純合體種子在發(fā)育的角果中顏色透明、胚胎發(fā)育遲緩，成熟后干種子體積小、皺縮，在土中不能直接萌發(fā)，而在含有蔗糖的MS培養(yǎng)基上表現(xiàn)為生長發(fā)育嚴重滯后、植株矮小等[21]。然而對于APPR6在擬南芥中的其他功能仍有待研究。

本研究通過鑒定APPR6另外2個T-DNA插入突變體SALK_078430（appr6-4）與SALK_005601（appr6-5）在種子萌發(fā)與萌發(fā)后幼苗早期生長過程中對ABA的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn) APPR6 參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為進一步闡明線粒體PPR蛋白的作用機制以及ABA信號網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col）種子購自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，Ohio State University，USA，簡稱ABRC）。

APPR6（At1g77360）基因T-DNA插入突變體SALK_078430（appr6-4）以及SALK_005601（appr6-5）種子購自ABRC，其遺傳背景為Col生態(tài)型。

ABI1（AT4G26080）基因T-DNA插入突變體abi1-3（SALK_076309）、ABI2（AT5G57050）基因T-DNA插入突變體abi2-2（SALK_015166）購自ABRC，其遺傳背景為Col生態(tài)型。abi1-3 abi2-2雙突變體純合體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭巖教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥種植 將適量擬南芥種子用0.5%次氯酸鈉（NaClO）表面消毒，振蕩20 min后用無菌水漂洗5次，播種于固體MS[22]培養(yǎng)基（MS干粉 4.43 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂 7～8 g/L，pH值5.8～6.0）上，將培養(yǎng)皿置于4 ℃環(huán)境中低溫處理3 d后取出，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，光周期為光照16 h—黑暗8 h，溫度20 ℃，光照度約80 μmol/（m2·s）。將適齡幼苗移栽入小盆中，種植用土的成分體積配比為營養(yǎng)土 ∶草炭土 ∶蛭石=2 ∶1 ∶1。幼苗覆膜培養(yǎng)5 d后揭膜，光周期為光照16 h—黑暗8 h，溫度22～24 ℃，光照度為120 μmol/（m2·s）。

1.2.2 T-DNA插入突變體鑒定 采用表1中所示引物對突變體進行鑒定。T-DNA插入突變體appr6-4和appr6-5純合體基因組DNA用自身基因RP引物與T-DNA序列LBa1引物可以擴增出特異條帶，而LP+RP引物擴增不出條帶；野生型或無插入植株基只有LP+RP引物能擴增出目的條帶。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；之后72 ℃總延伸 10 min。

進一步對突變體的T-DNA序列插入位置進行分析。以突變體純合體植株的基因組DNA為模板，用T-DNA序列左右端引物L(fēng)Ba1 5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3′、RBa1 5′-TGGTTCACGTAGTGGG CCATCG-3′分別與基因組序列兩端引物RP、LP（表1）擴增，將所得目的擴增產(chǎn)物片段用凝膠回收試劑盒回收，之后重組到克隆載體上（pEASY-T1），送至北京Life Technologies測序并比對分析T-DNA插入位置。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達 采用通用植物總RNA提取試劑盒提取不同植物材料RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量PCR分析。所用的引物如表2所示。反應(yīng)體系（10 μL）中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，正向引物與反向引物（20 μmol/L）各0.1 μL，cDNA 模板0.2 μL，ddH2O補至10 μL。每個反應(yīng)體系重復(fù)3次，充分混勻，短暫離心后采用CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進行擴增。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s讀取熒光值并重復(fù)40個循環(huán)，95 ℃ 10s，65 ℃升溫至95 ℃，每次上升0.5 ℃，每次5 s讀取熒光值。數(shù)據(jù)分析：CT值為PCR反應(yīng)熒光信號達到所設(shè)域值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，ΔCT為目的基因引物CT（APPR6）與內(nèi)參引物CT（Actin）值之差，ΔΔCT為處理組與對照組ΔCT之差，以2-ΔΔCT衡量標準化后基因表達差異。

1.2.4 種子萌發(fā)試驗 將適量擬南芥種子表面消毒后，播種在含有不同濃度（±） ABA的固體MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4 ℃左右低溫處理2～3 d后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中。種子萌發(fā)以種子露白作為記錄標準，分別在不同時間點（12、24、36、48、60、72 h）記錄不同基因型種子對應(yīng)的萌發(fā)數(shù)量。按照公式“萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)/總數(shù)×100%”對萌發(fā)率數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 幼苗萌發(fā)后生長試驗 將適量擬南芥種子表面消毒后，播種在含有不同濃度（±）ABA的固體MS培養(yǎng)基上，經(jīng) 4 ℃ 低溫層積處理2～3 d后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，經(jīng)適當(dāng)生長天數(shù)（10 d）后觀察記錄幼苗生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體appr6-4和appr6-5的T-DNA插入位點鑒定

之前報道的T-DNA插入突變體SALK_045714（appr6-1）和SALK_091917（appr6-2）均插入擬南芥APPR6基因起始密碼子下游1 435 bp，SALK_061950（appr6-3）插入擬南芥APPR6基因起始密碼子下游1 449 bp，這幾個突變體純合體種子胚胎發(fā)育異常、不能正常萌發(fā)生長；在添加蔗糖的培養(yǎng)基上生長出的植株移入土中生長后，其株高與角果大小均顯著小于野生型，生長嚴重滯后。

本研究選擇APPR6另外2個T-DNA插入突變體SALK_078430（appr6-4）與SALK_005601（appr6-5）。appr6-4突變體中T-DNA插入APPR6基因啟動子區(qū)，即起始密碼子ATG上游第271 bp到第254 bp之間，插入造成約18 bp堿基缺失；appr6-5突變體中T-DNA插入APPR6基因起始密碼子ATG下游1539 bp到終止密碼子TGA下游37 bp 之間，插入造成約52 bp堿基缺失（圖1）。

同時，與野生型相比，appr6-4和appr6-5突變體的純合體種子形態(tài)與野生型接近，并能夠正常萌發(fā)，在土中可繼續(xù)生長；進入生殖生長階段，僅appr6-5在早期（35 d前）表現(xiàn)出株高（花序高度）較低、生長滯后，然而在42 d后appr6-4和appr6-5突變體與野生型相比植株高度差異不顯著（圖2）。因此選擇appr6-4和appr6-5突變體作為遺傳材料進行后續(xù)研究。

2.2 APPR6基因表達在種子中最高并受到ABA誘導(dǎo)

首先檢測了擬南芥不同生長時期APPR6表達變化情況（圖3-A）。采用實時熒光定量PCR檢測野生型低溫層積處理3 d后生長24 h種子、生長12 d幼苗和21 d幼苗中APPR6基因表達情況，發(fā)現(xiàn)APPR6在種子中表達量顯著上調(diào)。在基因表達數(shù)據(jù)公共網(wǎng)站Arabidopsis eFP Browser（http：//bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）（圖3-C）以及Genevestigator（http：//www.genevestigator.com）（圖3-D）查找生物芯片檢測相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)APPR6在不同組織、器官中均有表達，并在種子中表達量最高。這些數(shù)據(jù)與圖2-A中試驗結(jié)果基本一致。

進一步檢測了ABA處理后APPR6基因表達變化，結(jié)果圖3-B表明。施加不同濃度（±） ABA（0、1、3 μmol/L）低溫處理3 d后生長24 h的野生型Col種子中，APPR6表達隨ABA濃度升高而顯著升高。

2.3 APPR6調(diào)控種子萌發(fā)對ABA的響應(yīng)

植物種子休眠與萌發(fā)過程受到ABA的調(diào)控，外源ABA會在一定程度上抑制種子的正常萌發(fā)過程。為研究APPR6在種子萌發(fā)過程中對ABA敏感性的影響，采用ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)抑制試驗檢測不同基因型種子在萌發(fā)過程中對ABA敏感性的差異。用ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)節(jié)子編碼基因ABI1與ABI2雙突變體abi1-3 abi2-2作為對ABA敏感的對照，將野生型Col、突變體appr6-4和appr6-5、雙突變體abi1-3 abi2-2的種子播種在無ABA（0 μmol/L）以及含有（±）ABA（05、1 μmol/L）的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4 ℃低溫處理約3 d后放入光照培養(yǎng)箱中正常生長，計算其在12 ～72 h的萌發(fā)率，統(tǒng)計結(jié)果如圖4所示。在不含ABA的MS培養(yǎng)基上，野生型Col、appr6-4和appr6-5突變體種子在生長36 h后萌發(fā)率均可達到100%。而在含有不同濃度（±） ABA（05、1 μmol/L）的MS培養(yǎng)基上，與野生型Col相比，appr6-4和appr6-5突變體的萌發(fā)率受到ABA顯著抑制，其超敏程度低于雙突變體abi1-3 abi2-2。

2.4 APPR6調(diào)控幼苗早期生長對ABA的響應(yīng)

高濃度ABA能夠抑制植物幼苗生長。為研究APPR6對幼苗早期生長過程中對ABA敏感性的影響，采用ABA誘導(dǎo)的萌發(fā)后生長抑制試驗檢測不同基因型幼苗早期生長過程中對ABA敏感性的差異。用ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)節(jié)子編碼基因ABI1與ABI2雙突變體abi1-3 abi2-2作為對ABA敏感的對照。

將不同基因型種子直接播種在無ABA（0 μmol/L）以及含有不同濃度（±） ABA的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4 ℃低溫處理約3 d后放入光照培養(yǎng)箱中正常生長10 d，結(jié)果如圖5所示。在無ABA（0 μmol/L）培養(yǎng)基上，除appr6-5根長略短、表現(xiàn)出顯著生長滯后外，其他基因型植物根長差異不顯著。在含有0.3 μmol/L ABA的MS培養(yǎng)基上，appr6-5突變體的子葉不能變綠伸展、胚軸與根部生長受到ABA顯著抑制，appr6-4盡管超敏程度低于appr6-5突變體，但根系生長受到ABA抑制程度顯著高于野生型（圖5-A、圖5-B）。在0.5 μmol/L ABA的MS培養(yǎng)基上，appr6-4受到ABA抑制程度仍顯著高于野生型，appr6-5突變體的生長狀態(tài)與雙突變體abi1-3 abi2-2接近（圖5-A、圖5-B）。為排除appr6-5根長生長滯后的影響，以無ABA（0 μmol/L）培養(yǎng)基上根長數(shù)值為參照，將不同材料根長換算為相對值（圖5-C），其結(jié)果與圖 5-B中根長變化趨勢一致。

3 結(jié)論與討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)擬南芥線粒體PPR蛋白APPR6參與ABA調(diào)控種子萌發(fā)與幼苗生長。在種子中APPR6的表達量最高，且受到外源ABA誘導(dǎo)。利用APPR6的另外2個可以完成整個生命周期的T-DNA插入突變體appr6-4和appr6-5作為遺傳材料，發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)與萌發(fā)后幼苗生長過程中，與野生型相比，突變體appr6-4和appr6-5均表現(xiàn)出顯著的對ABA敏感的表型。這些證據(jù)表明APPR6參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

擬南芥APPR6在玉米中的同源蛋白是線粒體PPR蛋白MPPR6（MAGIv4_67802），主要在種子中表達，參與促進玉米線粒體中編碼核糖體蛋白S3的rps3 mRNA 5′端成熟以及翻譯起始，并影響胚胎發(fā)育；MPPR6在不同物種中結(jié)構(gòu)域功能的保守性較高，可恢復(fù)擬南芥appr6-3突變體的生長滯后表型[21]。APPR6以及MPPR6主要在種子中表達與其在種子階段的關(guān)鍵作用密切相關(guān)。

同時，在正常生長條件下，appr6-4（SALK_078430）的生長發(fā)育狀態(tài)與野生型差異不顯著，而appr6-5（SALK_005601）在早期幼苗生長過程中以及生殖生長初期表現(xiàn)出發(fā)育滯后表型；并且在萌發(fā)后生長過程中，appr6-5對ABA的超敏程度顯著高于appr6-4。然而這2個突變體均能正常完成整個生命周期，純合體種子外觀與野生型差異不顯著。根據(jù)APPR6的結(jié)構(gòu)特征[21]，之前報道的純合體致死、 胚胎發(fā)育發(fā)生嚴重異常的突變體株系SALK_045714（appr6-1）、SALK_091917（appr6-2）和SALK_061950（appr6-3）的 T-DNA 插入擬南芥APPR6基因的區(qū)段對應(yīng)APPR6蛋白PPR結(jié)構(gòu)域。突變體appr6-4的T-DNA插入在APPR6啟動子區(qū)，其基因全長序列未受到影響；而appr6-5的T-DNA插入位點對應(yīng)APPR6蛋白C端遠離PPR結(jié)構(gòu)域的位置。這表明APPR6中PPR結(jié)構(gòu)域的完整性對其正常行使功能至關(guān)重要。

本研究為進一步闡明線粒體PPR蛋白的作用機制以及ABA信號網(wǎng)絡(luò)提供了新的信息。進一步對擬南芥APPR6可能結(jié)合的RNA靶標進行篩選，并研究其表達變化對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因表達的影響，有助于理解其可能的作用機制。此外由于ABA是重要的抗逆激素，對APPR6在干旱、鹽、低溫、滲透脅迫等主要非生物逆境中的功能有待后續(xù)鑒定。

參考文獻：

[1]Small I D，Peeters N. The PPR motif—a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins[J]. Trends in Biochemical Sciences，2000，25（2）：46-47.

[2]Lurin C，Andres C，Aubourg S，et al. Genome-wide analysis of Arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis[J]. Plant Cell，2004，16（8）：2089-2103.

[3]Schmitz-Linneweber C，Small I. Pentatricopeptide repeat proteins：a socket set for organelle gene expression[J]. Trends in Plant Science，2008，13（12）：663-670.

[4]Liu Y，He J，Chen Z，et al. ABA overly-sensitive 5 （ABO5），encoding a pentatricopeptide repeat protein required for cis-splicing of mitochondrial nad2 intron 3，is involved in the abscisic acid response in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2010，63（5）：749-765.

[5]Chateigner-Boutin A，des Francs-Small C C，Delannoy E，et al. OTP70 is a pentatricopeptide repeat protein of the E subgroup involved in splicing of the plastid transcript rpoC1[J]. Plant Journal，2011，65（4）：532-542.

[6]de Longevialle A F，Meyer E H，Andres C，et al. The pentatricopeptide repeat gene OTP43 is required for trans-splicing of the mitochondrial nad1 intron 1 in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell，2007，19（10）：3256-3265.

[7]Pfalz J，Bayraktar O A，Prikryl J，et al. Site-specific binding of a PPR protein defines and stabilizes 5′ and 3′ mRNA termini in chloroplasts[J]. EMBO Journal，2009，28（14）：2042-2052.

[8]Sung T Y，Tseng C C，Hsieh M H. The SLO1 PPR protein is required for RNA editing at multiple sites with similar upstream sequences in Arabidopsis mitochondria[J]. Plant Journal，2010，63（3）：499-511.

[9]Zhu Q，Dugardeyn J，Zhang C，et al. SLO2，a mitochondrial pentatricopeptide repeat protein affecting several RNA editing sites，is required for energy metabolism[J]. Plant Journal，2012，71（5）：836-849.

[10]Yuan H，Liu D. Functional disruption of the pentatricopeptide protein SLG1 affects mitochondrial RNA editing，plant development，and responses to abiotic stresses in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2012，70（3）：432-444.

[11]Murayama M，Hayashi S，Nishimura N，et al. Isolation of Arabidopsis ahg11，a weak ABA hypersensitive mutant defective in nad4 RNA editing[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（14）：5301-5310.

[12]Meierhoff K，F(xiàn)elder S，Nakamura T，et al. HCF152，an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat protein involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs[J]. Plant Cell，2003，15（6）：1480-1495.

[13]Prikryl J，Rojas M，Schuster G，et al. Mechanism of RNA stabilization and translational activation by a pentatricopeptide repeat protein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（1）：415-420.

[14]Yin P，Li Q，Yan C，et al. Structural basis for the modular recognition of single-stranded RNA by PPR proteins[J]. Nature，2013，504（7478）：168-171.

[15]Cutler S R，Rodriguez P L，F(xiàn)inkelstein R R，et al. Abscisic acid：emergence of a core signaling network[J]. Annual Review of Plant Biology，2010，61：651-679.

[16]Finkelstein R R，Gampala S S L，Rock C D. Abscisic acid signaling in seeds and seedlings[J]. Plant Cell，2002，14（Suppl）：S15-S45.

[17]Chetrit P，Rios R，De Paepe R，et al. Cytoplasmic male sterility is associated with large deletions in the mitochondrial DNA of two Nicotiana sylvestris protoclones[J]. Current Genetics，1992，21（2）：131-137.

[18]Wang Z H，Zou Y J，Li X Y，et al. Cytoplasmic male sterility of rice with boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing[J]. Plant Cell，2006，18（3）：676-687.

[19]Zsigmond L，Rigó G，Szarka A，et al. Arabidopsis PPR40 connects abiotic stress responses to mitochondrial electron transport[J]. Plant Physiology，2008，146（4）：1721-1737.

[20]Laluk K，Abuqamar S，Mengiste T. The Arabidopsis mitochondria-localized pentatricopeptide repeat protein PGN functions in defense against necrotrophic fungi and abiotic stress tolerance[J]. Plant Physiology，2011，156（4）：2053-2068.

[21]Manavski N，Guyon V，Meurer J，et al. An essential pentatricopeptide repeat protein facilitates 5′ maturation and translation initiation of rps3 mRNA in maize mitochondria[J]. Plant Cell，2012，24（7）：3087-3105.

[22]Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture[J]. Physiol Plant，1962，15：473-497. 馬芳芳，蔣明義. 外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：58-61.