斑馬魚嗜水氣單胞菌的鑒定和人工感染組織病理學研究

林金杏楊遲，2馮麗萍胡建華

（1. 上海實驗動物研究中心，上海 201203；2. 東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

斑馬魚嗜水氣單胞菌的鑒定和人工感染組織病理學研究

林金杏1楊遲1，2馮麗萍1胡建華1

（1. 上海實驗動物研究中心，上海 201203；2. 東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

從患病斑馬魚體內(nèi)分離致病菌株并進行鑒定，觀察人工感染分離菌株后組織病理學變化。通過對分離菌株ZF4形態(tài)特征、生理生化特性、保守基因和系統(tǒng)發(fā)育樹建立等綜合分析進行鑒定。結果顯示，ZF4為β溶血的革蘭氏陰性短桿菌，吲哚試驗為陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖等糖類，AHA_0438、ASP、gyrB和16S rRNA等基因均為陽性，基于gyrB、16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示ZF4為嗜水氣單胞菌。人工感染后斑馬魚臨床癥狀明顯，發(fā)生肝臟組織變性、腸道內(nèi)膜脫落、脾臟充血、胰腺間質纖維組織增生等組織病理學變化。斑馬魚體內(nèi)分離的ZF4鑒定為致病性嗜水氣單胞菌，且斑馬魚對該菌敏感，因此斑馬魚可作為研究嗜水氣單胞菌的動物模型。

斑馬魚；嗜水氣單胞菌；鑒定；人工感染；組織病理

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），廣泛分布于自然界的各種水體及土壤中［1，2］。Ah是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，也為條件致病菌，會導致水產(chǎn)動物的出血癥，病勢較猛，死亡率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［3］。此外，Ah可通過接觸被污染的水和水產(chǎn)動物性食品、傷口或攝入感染人類，引起人類腹瀉、急性腸胃炎等，是典型的人-獸-魚共患病病原菌［2，4，5］。近年來，隨著水生實驗動物的廣泛應用，特別是國內(nèi)外眾多實驗室以斑馬魚為模式動物進行大量科學研究，使Ah的檢測與控制研究顯得尤為重要，引起了生命科學界及水產(chǎn)學界科研工作者的廣泛重視［6，7］。

Ah可依據(jù)其是否具有致病性將其分為致病菌株與非致病菌株兩大類，而Ah的致病性則與其毒力因子密切相關［8，9］?，F(xiàn)已有許多學者針對Ah病原的毒力因子開展了大量研究，證實Ah所分泌的溶血素、氣溶素、胞外蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等是Ah重要的毒力因子，與該菌是否具有致病性及致病性的強弱具有較高的相關性［10，11］。本研究從發(fā)病的斑馬魚組織中分離病原菌，對其生物學性狀、生理生化特性、致病力、保守基因、基于gyrB、16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，以及人工感染Ah后斑馬魚主要器官的組織病理變化進行研究，旨在為斑馬魚細菌質量控制和實驗人員防護提供重要的理論指導和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取本單位（實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2013-0056）隔離飼養(yǎng)區(qū)的自然發(fā)病斑馬魚作為實驗樣本，其臨床病理特征主要表現(xiàn)為魚體消瘦，鰓部充血發(fā)紅，嚴重者爛鰓爛尾，魚側身體表潰瘍出血。此外，選取飼養(yǎng)于獨立水生動物養(yǎng)殖系統(tǒng)（意大利TECNIPLAST公司）的體長約4 cm、體重在0.6-0.9 g范圍內(nèi)，健康活潑、無異樣病癥的10月齡AB系野生型斑馬魚（其中雌雄各半）用于分離菌的人工感染致病性試驗。

1.1.2 主要試劑 羊血瓊脂平板、TSA、TSB、Rimler-Shotts（RS）培養(yǎng)基、MMA培養(yǎng)基，細菌基因組DNA提取試劑盒、Es Taq Master Mix、DNA純化回收試劑盒，蘇木素、伊紅、NaOH、無水乙醇、丙三醇、二甲苯、冰乙酸等。

嗜水氣單胞菌陽性對照菌株由中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）提供，菌株編號為：CGMCC 1.2017，配置批號：2012.11.21。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 以無菌操作方式解剖斑馬魚，取其體表病灶組織及腹腔器官團進行組織勻漿，接種于羊血瓊脂平板，30℃培養(yǎng)10-24 h，取優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)。本文分離的菌株為本實驗室從斑馬魚體內(nèi)分離出的第4個菌株，編號為ZF4。

1.2.2 分離菌株形態(tài)觀察與生理生化特性鑒定 將純培養(yǎng)所獲得的病原菌接種于TSA平板培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色及邊緣是否整齊、凸起等，并涂片進行革蘭氏染色鏡檢，進行細菌的初步鑒定。根據(jù)染色結果，應用細菌生化微量鑒定管進行細菌的常規(guī)生理生化測定，并采用ID32E微量多項試驗鑒定系統(tǒng)（ATB Expression 儀，法國生物梅里埃公司）進行細菌鑒定。

1.2.3 DNA提取及PCR擴增 分離菌及陽性對照菌的DNA提取依細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進行。利用oligo 6軟件設計并合成4對保守基因引物（表1），PCR反應條件為94℃ 5 min，94℃ 45 s，退火45 s，72℃ 1 min，35 C，72℃ 10 min。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序及分析 用DNA純化回收試劑盒對gyrB和16S rRNA的擴增產(chǎn)物進行回收，并送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。獲得序列采用Blast進行相似性比較，采用MEGA 5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.2.5 分離菌株致病性實 驗

1.2.5.1 平板計數(shù) 將陽性菌株與ZF4同時進行菌種復蘇，待傳代、培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)時對其進行計數(shù)實驗。菌液按1∶100比例分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，在1、2、2.5、3、3.5、4、5和6h八個時間點各取出對應試管測OD值，并選取處于細菌生長對數(shù)期的中間6個時間點進行平板計數(shù)。

1.2.5.2 人工感染 實驗開始前2日將健康的斑馬魚隨機分為7組（6實驗組+1對照組），每組6尾，雌雄各半，分別飼養(yǎng)于7個飼養(yǎng)缸內(nèi)，以適應環(huán)境，感染實驗開始前禁食24 h。按1∶100比例分別轉接陽性菌株和分離菌株ZF4，30℃培養(yǎng)至3.5 h時，采樣測量兩種菌株的OD值，按平板計數(shù)所得的擬合曲線得出菌液濃度，并分別稀釋成3個梯度濃度的菌液。利用腹腔注射的方法分別對6個實驗組中的每尾受試斑馬魚注射不同濃度梯度的菌液各10 μL，對照組每尾注射10 μL PBS，觀 察7 d內(nèi)受試斑馬魚的活力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況。

1.2.6 組織切片的制作與病理學變化的觀察 選取人工感染后具有典型發(fā)病癥狀的瀕死斑馬魚，在立體顯微鏡（SZX7，Olympus）下進行解剖，摘取感染病魚的鰓絲直接置于顯微鏡下觀察病理變化，取內(nèi)臟器官組織固定于10%甲醛溶液24 h后，脫水后以石 蠟包埋，切片厚4 μm，采用常規(guī)方法進行HE染色，光學顯微鏡（DP80，Olympus）下觀察拍照。

1.2.7 再次分離鑒定致病菌 將人工感染致死的斑馬魚在無菌條件下剖開腹部，用接種環(huán)沾取腹腔積液接種至TSA培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)過夜后，挑選優(yōu)勢菌落進行分離純化后，轉接至RS、 MMA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，菌落鑒定的形態(tài)觀察、生理生化鑒定及分子生物學等方法，再次進行分離菌落和分析鑒定。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)特征

取優(yōu)勢菌株ZF4的純培養(yǎng)物接種于TSA培養(yǎng)基分別培養(yǎng)18-24 h后，菌落邊緣光滑整齊，中央凸起，有光澤，帶特殊芳香氣味，β溶血。革蘭氏染色鏡檢結果為陰性短桿菌。

2.2 分離菌株生理生化指標

分離菌株ZF4在所測項目中，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖和吲哚試驗等項目為陽性反應，鳥氨酸脫羧酶、酚紅、α-半乳糖苷酶、鼠李糖、肌醇、山梨醇等項目的反應為陰性。常規(guī)生理生化測定方法結合ATB系統(tǒng)細菌自動鑒定儀初步鑒定ZF4為Ah。

2.3 基因擴增結果

將ZF4及陽性對照菌株進行菌種復蘇并培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)后，針對Ah的保守基因AHA_0438、ASP、gyrB、16S rRNA的引物進行了PCR擴增，結果（圖1）顯示以上4對引物均可在ZF4及陽性對照菌株上擴增出目的條帶，且與對應的目標產(chǎn)物大小相符。

圖1 嗜水氣單胞菌PCR檢測結果

2.4 PCR產(chǎn)物測序結果及16S rRNA、gyrB基因序列分析

為進一步從分子水平上確認ZF4在氣單胞菌屬中的分型位置，將Ah的保守基因進行測序、同源性分析。結果顯示，ZF4的gyrB基因擴增產(chǎn)物同源性與GenBank中登錄的Ah（KAE13、KY07）同源性最高（98.5%），與其 他Ah的同源性在93.4%以上（圖2-A）；16S rRNA基因擴增產(chǎn)物的同源性與GenBank中登錄的其他Ah的均具有高同源性（97.7%以上），并與NQY 1、S5-41、Ah-13等Ah菌株同源性最高達99.6%（圖2-B）。從構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，無論是基于gyrB基因還是16S rRNA基因的序列，結果均顯示ZF4與Ah聚為一簇。

2.5 致病性實驗

2.5.1 平板計數(shù)結果 將分離菌株ZF4和Ah陽性菌株于30℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，根據(jù)不同時間點取出對應試管測得OD值繪制線性擬合曲線所對應的關系式（圖3），培養(yǎng)至3.5 h時菌體生長活性較好。陽性對照菌株和ZF4對應OD分別為0.607、0.731時，其所對應的菌落形成單位分別為8.16×1010CFU/mL、7.66×1010CFU/mL。然后，將陽性對照菌株稀釋成8.16× 1010、8.16×109和8.16×108CFU/mL，ZF4稀釋成7.66×1010、7.66×109和7.66×108CFU/mL注射，每尾注射菌液10 μL，對照組注射10 μL PBS。

圖2 基于gyrB基因（A）和16S rRNA（B）序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5.2 分離菌株ZF4致病力 斑馬魚在經(jīng)人工感 染病原菌后，斑馬魚雌雄個體表現(xiàn)差異不明顯，ZF4感染組和陽性對照組的表現(xiàn)癥狀基本一致，并且發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀也基本一致。初期均表現(xiàn)為食欲不振，游動緩慢，體表粘液分泌增多，后期出現(xiàn)身體側翻，失去平衡、腹部紅腫及鰭條基部充血（圖4-A）等病癥，解剖可見肝臟腫大，腹腔積水（圖4-B）。將感染病魚的鰓絲置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病魚鰓絲呈灰白色，末端彎曲伴有缺損現(xiàn)象，且附有大量粘液，鰓絲之間發(fā)生相互粘連現(xiàn)象，并有許多黑色附著物（圖4-D）。陽性對照菌株感染的斑馬魚中，8.16×1010CFU/mL組，在實驗3 d內(nèi)死亡率為50%；其他濃度注射組在實驗周期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，但部分魚體出現(xiàn)了食欲不振，腹部紅腫等病理癥狀。ZF4感染的斑馬 魚中，7.66×1010CFU/mL組，在實驗3 d內(nèi)死亡率為50%；其他濃度注射組在實驗周期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，亦有個體出現(xiàn)相似的病癥表現(xiàn)。對照組在7 d內(nèi)活動正常，未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡。

2.6 斑馬魚人工感染Ah的組織病理變化

將斑馬魚肝臟、腸道、脾臟等內(nèi)臟器官組織固定后進行HE染色切片，從病理切片來看，感染Ah陽性菌株和分離菌株ZF4病魚的器官組織均發(fā)生了較為明顯的變化，其中肝臟變化最為普遍和明顯。肝臟中均可見肝細胞腫脹變形，在血管周圍可見較多的含鐵血黃素沉積（圖5-B），部分細胞胞質消失，結構模糊，細胞間界限不明顯，實質中出現(xiàn)空泡變性甚至氣球性變性（圖5-C），在肝臟的邊緣可見明顯的炎性細胞增生（圖5-D）。與斑馬魚正常腸道結構（圖6-A）相比，感染病魚腸黏膜上皮細胞變性（圖6-B），嚴重者腸絨毛萎縮、上皮細胞大量壞死并脫落（圖6-C）。脾臟表現(xiàn)為組織充血、水腫（圖6-E），正常結構消失，部分感染者脾實質存在增生性結節(jié)（圖6-F）。胰腺的 變化主要有內(nèi)外分泌部分界不清晰、正常結構消失，出現(xiàn)大量 的炎性細胞（圖6-H），個別個體出現(xiàn)胰腺間質纖維組織增生（圖6-I）。

圖3 兩種菌株的線性擬合曲線

圖4 人工感染后斑馬魚臨床癥狀和鰓的變化

2.7 感染菌再分離鑒定

將ZF4人工感染實驗發(fā)病致死的斑馬魚置于無菌條件下，從腸道中再次分離細菌，并進行細菌培養(yǎng)和菌落鑒定，獲得與原感染菌ZF4形態(tài)及生理生化特征一致的細菌。

圖5 人工感染后斑馬魚肝臟的組織病理變化

圖6 人工感染后斑馬魚腸道、脾臟和胰腺的組織病理變化

3 討論

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是氣單胞菌屬細菌中較早的成員，是一種在水體中廣泛存在的細菌，可引起魚類及其他水產(chǎn)動物的多種病害，尤其對密集型養(yǎng)殖的水生生物危害更為嚴重［12］。而在實驗室條件下，水生實驗動物（以斑馬魚為代表）正是以密集方式養(yǎng)殖，微生物質量控制是評價實驗動物質量的重要指標，如何有效進行微生物的檢測和控制已引起科研人 員的廣泛關注。本研究中從發(fā)病斑馬魚體內(nèi)分離到1株β溶血的革蘭氏陰性短桿菌ZF4，其菌落為光滑、微凸、圓整、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味，與GB/T 18652-2002描述的一致［13］。經(jīng)生物學特性和生化特性分析，初步鑒定為Ah。

Ah物種的異質性對用傳統(tǒng)生化方法來鑒別提出了挑戰(zhàn)［14］，分子生物學方法已被普遍應用于Ah的鑒定。根據(jù)嗜水氣單胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及絲氨酸蛋白酶基 因，凌空等［15］建立了一種檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌的四重PCR法。本研究對分離菌ZF4進行了Ah的氣溶素基因AHA_0438、胞外絲氨酸蛋白酶基因ASP、gyrB、16S rR NA的PCR鑒定，結果顯為陽性，目的條帶與陽性對照菌株的結果相符。識別Ah最準確的方法是管家基因測序［16］，一般選用gyrB基因和16S rRNA［17，18］。gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，普遍存在于各種細菌中，其序列具有保守性和變異性，可作為系統(tǒng)發(fā)育的靶標，廣泛應用于以核苷酸序列為基礎的細菌分類及鑒別研究中［19］。此外，gyrB基因是否發(fā)生突變是在進行研制Ah有效的疫苗時重點關注的［20］。以16S rRNA為目的基因的PCR鑒定方法最為成熟，Ah能在16S rRNA基因擴增區(qū)得到有效擴增，而非氣單胞菌屬的菌株，在此擴增區(qū)都為陰性［21］。本研究選取了保守基因gyrB及16S rRNA對分離菌株ZF4進行同源性分析。結果顯示，gyrB基因及16S rRNA基因擴增產(chǎn)物的同源性與GenBank中登錄的其他Ah的同源性在分別在93.4%與97.7%以上。從構建的系統(tǒng)發(fā)育上可以看出，無論是基于gyrB基因還是16S rRNA基因的序列，聚類分析結果均顯示分離菌株ZF4與Ah聚為一簇。由此可以從分子水平確定分離的ZF4為Ah。

Ah感染臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征，慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚 潰瘍或腸炎［13］。杜雄偉等［22］通過人工感染實驗表明，嗜水氣單胞菌可使劍尾魚產(chǎn)生敗血癥，組織病理學變化以全身溶血性貧血和廣泛的組織細胞變性、壞死為主，各臟器均發(fā)生變質性病變。徐祥等［23］對Ah感染的雜交鱘進行了組織病理學研究，患病雜交鱘鰓絲腐爛、色淺或呈紫黑色，腹腔壁及內(nèi)臟器官可見出血斑；肝、腎、脾等內(nèi)臟器官均有組織病理變化。本研究選取健康的野生型斑馬魚進行了Ah人工感染致病性實驗，旨在確定Ah對斑馬魚的致病力以及組織病理學變化。Ah人工感染的斑馬魚出現(xiàn) 病變、死亡，組織病理學研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的主要器官（包括肝臟、腸道、脾臟、胰腺）均有明顯的病理變化，典型癥狀為肝臟組織變性、腸道內(nèi)膜脫落、脾臟充血。由此可見，斑馬魚對Ah菌株敏感，易病變。

4 結論

從患病斑馬魚體內(nèi)分離的致病菌株鑒定為致病性嗜水氣單胞菌，且人工感染后致病力和組織病理學研究顯示斑馬魚對該菌敏感，因此斑馬魚可作為研究嗜水氣單胞菌的動物模型。

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（責任編輯 李楠）

Identification of Aeromonas hydrophila and Histopathological Observation of Artificial Infected Zebrafish

LIN Jin-xing1YANG Chi1，2FENG Li-ping1HU Jian-hua1
（1. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203；2. College of Chemistry，Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620）

The aims of this paper are to isolate and identify pathogenic strain from diseased zebrafish，and to observe the histopathological changes of artificial infected zebrafish. The isolated strain ZF4 was identified by comprehensive analysis of its morphology，physiological and biochemical characteristics，conserved gene and phylogenetic tree. The results showed that the ZF4 was gram negative bacillus，positive in indole test，fermented glucose，sucrose sugars，etc. The gene AHA_0438，ASP，gyrB and 16S rRNA of ZF4 were all positive. Based on gyrB and 16S rRNA gene sequence，clustering analysis result showed that ZF4 was Aeromonas hydrophila. The infected zebrafish presented obvious clinical symptoms，and histopathological changes were observed，such as the liver tissue degeneration，intestinal lining shedding，hyperemia of the spleen，pancreas fibrous tissue hyperplasia.，etc. In conclusion，the ZF4 isolated from the diseased zebrafish was identified as pathogenicity A. hydrophila. Meanwhile，due to its susceptibility，zebrafish could be used as the animal model to study the A. hydrophila.

zebrafish；Aeromonas hydrophila；identification；artificial infection；histopathology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.032

2015-04-15

國家科技支撐計劃課題（2013BAK11B02），上海市科技發(fā)展基金項目（15140901000）

林金杏，女，博士，副研究員，研究方向：實驗用魚質量控制及形態(tài)學，E-mail：linjinxing83@163.com；楊遲同為本文第一作者

胡建華，男，研究員，研究方向：實驗動物質量控制；E-mail：jhhu@live.cn