3種方法去除葡萄酒中酒香酵母污染效果對(duì)比分析

傅曉方，王煥香，商華，白佑鉑，朱亞楠，郜成軍，趙曉寧，王圣杰（. 中國(guó)長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北懷來　075400；. 中糧長(zhǎng)城葡萄酒（涿鹿）有限公司，河北涿鹿　075600）

?

3種方法去除葡萄酒中酒香酵母污染效果對(duì)比分析

傅曉方1，王煥香1，商華1，白佑鉑1，朱亞楠1，郜成軍1，趙曉寧1，王圣杰2
（1. 中國(guó)長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北懷來075400；2. 中糧長(zhǎng)城葡萄酒（涿鹿）有限公司，河北涿鹿075600）

摘要：酒香酵母是葡萄酒廠常見的微生物污染之一，常存在于空間環(huán)境、設(shè)備及葡萄酒中。在釀酒過程中，酒香酵母可利用葡萄酒原料中的前體物質(zhì)產(chǎn)生4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG），低濃度下增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，高濃度下產(chǎn)生典型的“馬廄味”不良風(fēng)味，降低葡萄酒的香氣和口感，影響葡萄酒的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文通過對(duì)比適用于葡萄酒廠的去除酒香酵母污染、避免不良風(fēng)味產(chǎn)生的不同方法，發(fā)現(xiàn)使用抑制酒香酵母多糖以及合理控制葡萄酒中游離二氧化硫含量，可以有效的降低葡萄酒中酒香酵母的含量，降低其對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；酒香酵母；不良風(fēng)味；防控

酒香酵母是葡萄酒廠常見的微生物污染之一，最早在啤酒中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已知其廣泛存在于啤酒、葡萄酒以及各種果汁飲料中［1］。目前酒香酵母主要有以下幾個(gè)種：Brettanomyces custersianus，Brettanomyces naardenensis，Brettanomyces nanus，Brettanomyces anomalus和Brettanomyces bruxellensis［2］。酒香酵母產(chǎn)生的糖苷酶可以將葡萄漿中的結(jié)合態(tài)糖苷鍵形式風(fēng)味前體化合物分解，釋放出具有揮發(fā)性香氣的物質(zhì)，在增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性的同時(shí)，產(chǎn)生的4-乙基苯酚（4-PE）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-EG）具有馬廄味、鼠尿味、皮革味、醫(yī)藥味等令人不愉悅的氣味［3］。這些香氣共同作用，形成了酒香酵母屬的風(fēng)味特征［4］。當(dāng)4-EP與4-PG的含量分別超過605 μg/mL和100 μg/mL時(shí)將被人察覺到，表現(xiàn)為創(chuàng)可貼、鼠尿、馬汗等不良風(fēng)味，降低葡萄酒帶來的感官享受，引起消費(fèi)者的抗拒，從而造成酒廠的經(jīng)濟(jì)損失。

酒香酵母在葡萄酒廠存在較為廣泛：葡萄園中以及生產(chǎn)車間的空氣、墻面、地面、儲(chǔ)酒容器、橡木桶、釀造設(shè)備和葡萄酒等，均有可能感染酒香酵母。尤其以橡木桶最易感染酒香酵母，因?yàn)橄鹉就皟?nèi)壁不規(guī)則的表面上有供其代謝的二糖或纖維二糖，可以為酒香酵母提供理想的生長(zhǎng)環(huán)境。

目前酒香酵母已經(jīng)引起了國(guó)際葡萄酒行業(yè)的極大關(guān)注，國(guó)外眾多高校以及研究單位都對(duì)其進(jìn)行了的研究。2014年曹培鑫等［1］對(duì)部分酒廠取樣檢測(cè)的結(jié)果表明，部分產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中存在酒香酵母污染，應(yīng)引起酒廠足夠的關(guān)注。

酒香酵母對(duì)環(huán)境有著較強(qiáng)的耐受能力，使葡萄酒廠對(duì)酒香酵母的防控存在困難。有研究表明：大約25%的酒香酵母可在以乙醇為唯一碳源的環(huán)境下生長(zhǎng)，約10%左右的菌株可在可溶性淀粉中生長(zhǎng)［5］。大多數(shù)酒香酵母可將硝酸鹽作為唯一氮源生長(zhǎng)。同時(shí)酒香酵母有著較高的酒精適應(yīng)能力，可以耐受高達(dá)14%～14.5%的酒精度。酒香酵母在pH2.5的條件下可以生長(zhǎng)，其中94%的菌株在pH2.0時(shí)仍可生長(zhǎng)。有1/3的酒香酵母屬菌株可以在37 ℃以上的環(huán)境中生長(zhǎng)，1/3左右的菌株可以在低于10 ℃的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。本文針對(duì)酒香酵母的特征，結(jié)合葡萄酒廠的實(shí)際情況，采用生物學(xué)方法、物理學(xué)方法以及化學(xué)方法對(duì)赤霞珠干紅葡萄原酒中酒香酵母防治方法進(jìn)行了對(duì)比分析研究，尋找適于葡萄酒廠生產(chǎn)實(shí)踐使用的，可以顯著降低葡萄酒中酒香酵母含量及產(chǎn)生不良風(fēng)味的風(fēng)險(xiǎn)的方法。

1　材料與方法

1.1材料

赤霞珠干紅葡萄原酒，抑酒香酵母多糖STAB MICRO，滅菌具塞三角瓶，焦亞硫酸鉀，NaCa皂土，0.45 μm濾膜，WLN培養(yǎng)基，PALL無菌過濾系統(tǒng)，PALL錯(cuò)流過濾機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2方法

取同一有酒香酵母檢出的葡萄酒作為試驗(yàn)用酒，分別采用生物學(xué)方法（抑酒香酵母多糖）、物理學(xué)方法（澄清過濾法）以及化學(xué)方法（SO2殺菌法）處理葡萄酒。用滅菌三角瓶取100 mL處理后的酒液，離心收集菌體，用1 mL無菌水懸浮菌體，涂布于WLN篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1周左右。酒香酵母在WLN培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為扁平、表面光滑不透明、黃油狀、中間綠色邊緣奶油色的半圓形菌落，菌落計(jì)數(shù)并分離單菌落。通過對(duì)比不同方法處理后酒液中酒香酵母含量的變化情況，比較其除菌效果。

1.2.1生物學(xué)方法除菌

抑酒香酵母多糖是一種從黑曲霉中提取出的天然多糖，可以特異性地結(jié)合酵母的細(xì)胞壁，從而達(dá)到抑制酒香酵母的作用。本試驗(yàn)按照0 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L的濃度梯度向試驗(yàn)用酒中添加抑酒香酵母多糖。具體方法為：按照濃度梯度及所用原酒的數(shù)量準(zhǔn)確計(jì)算稱取所需抑酒香酵母多糖重量，按照1︰20的比例將其預(yù)溶解至原酒中，輕輕攪拌，避免結(jié)塊；攪拌均勻后將其緩慢添加至待處理原酒中，攪拌30 min，靜置，分別于3 d，6 d，10 d取樣檢測(cè)酒香酵母含量。采用WLN培養(yǎng)基篩選法檢測(cè)酒香酵母的含量。

1.2.2物理方法除菌

葡萄酒工廠常用的物理除菌方法有澄清處理、離心處理及膜過濾等。將試驗(yàn)用基酒做如下處理：

（1）對(duì)照組：原酒存放于儲(chǔ)酒容器中，不經(jīng)過任何處理；

（2）NaCa皂土澄清處理：根據(jù)待處理原酒的數(shù)量，按照0.5 g/L的工作濃度準(zhǔn)確稱取NaCa皂土，用軟化水配制成濃度為5%（w/v）的溶液，靜置膨脹24 h，攪拌使其形成均勻的懸濁液后添加至原酒中，澄清7 d后分離清酒，用WLN鑒別培養(yǎng)基檢測(cè)處理后原酒中酒香酵母含量；

（3）按照0.5 g/L工作濃度的NaCa皂土溶液處理原酒，澄清7 d后分離清酒，用PALL錯(cuò)流過濾機(jī)對(duì)清酒進(jìn)行錯(cuò)流過濾；

（4）直接將葡萄酒進(jìn)行錯(cuò)流過濾，每處理3個(gè)重復(fù)，處理后分別取酒樣檢測(cè)酒香酵母含量。檢測(cè)酒香酵母采用WLN培養(yǎng)基篩選法。

1.2.3化學(xué)方法除菌

SO2在葡萄酒生產(chǎn)過程中起著重要的作用［6］。合理使用有利于控制葡萄酒中微生物的活動(dòng)，凈化發(fā)酵基質(zhì)，抗氧化等。使用不當(dāng)或濃度過高可能會(huì)造成葡萄酒脫色、產(chǎn)生不良風(fēng)味，對(duì)人產(chǎn)生毒害。首先檢測(cè)試驗(yàn)用原酒初始FSO2（游離態(tài)SO2）含量，本試驗(yàn)通過調(diào)整葡萄酒中的FSO2含量至20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L，研究其對(duì)酒香酵母的控制效果以及對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1生物學(xué)方法除菌效果分析

葡萄酒經(jīng)過不同濃度梯度的抑酒香酵母多糖處理后，所含酒香酵母的數(shù)量見表1。用量為0.1 g/L時(shí)即可以顯著地去除酒中的酒香酵母，3 d后能將酒香酵母含量降至較低的數(shù)值，10 d后可完全去除酒香酵母；用量增加至0.2 g/L時(shí)，6 d即可將葡萄酒中酒香酵母幾乎全部去除。

2.2物理方法除菌效果分析

三種物理除菌方法操作難易程度及除菌效果見表2。由表2可以看出，皂土處理可以降低原酒中酒香酵母含量，澄清處理后進(jìn)行錯(cuò)流過濾和直接過濾兩種方法可以將酒中的酒香酵母降至極低的水平，但直接過濾耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。與此同時(shí)，3種處理方法均可以提升原酒香氣的純凈度、優(yōu)雅性并使酒體澄清，但葡萄酒顏色稍有損失。

綜合比較上述3種物理方法的除酒香酵母效果，對(duì)原酒感官品質(zhì)的影響及操作難易程度，澄清處理后進(jìn)行錯(cuò)流過濾的方法可以有效的降低酒香酵母含量，并且過濾容易，成本低。

2.3化學(xué)方法除菌效果分析

SO2可以降低酒中酒香酵母的含量。調(diào)節(jié)FSO2含量至20 mg/L時(shí)，酒香酵母進(jìn)入休眠狀態(tài)，隨著時(shí)間推移，F(xiàn)SO2含量降低，酒香酵母繼續(xù)繁殖［7］。而FSO2含量過高則會(huì)降低葡萄酒的感官品質(zhì)。由從表3可以得出，F(xiàn)SO2含量維持在30 mg/L左右可以起到控制酒香酵母的作用，且對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)影響較小。

表1　不同抑酒香酵母多糖加量及處理時(shí)間對(duì)酒香酵母含量的影響

表2　不同物理方法去除酒香酵母效果對(duì)比

表3　不同F(xiàn)SO2濃度處理效果對(duì)比

3　討論與結(jié)論

酒香酵母問題困擾著很多葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)，如何對(duì)其進(jìn)行有效的防治并使其對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響最小化是亟待解決的技術(shù)難題。本試驗(yàn)對(duì)比了生物學(xué)方法（抑酒香酵母多糖）、物理學(xué)方法（澄清過濾法）以及化學(xué)方法（SO2殺菌法）3種不同處理方式去除葡萄酒中酒香酵母的效果，結(jié)果表明：抑酒香酵母多糖可以有效的降低葡萄酒中酒香酵母的含量，減少葡萄酒中酒香酵母屬不良風(fēng)味的產(chǎn)生，對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)無不良的影響。

Millet等［8］研究表明，過濾可將葡萄酒中微生物的含量降低1000倍左右，但不能除去處于休眠狀態(tài)的芽孢。休眠芽孢一旦遇到適宜的環(huán)境可能再次繁殖，對(duì)葡萄酒風(fēng)味造成不良影響。本文對(duì)比的三種物理學(xué)除菌方法中皂土處理后再進(jìn)行錯(cuò)流過濾的方法也可以有效的控制酒香酵母含量，提升香氣潔凈度，同時(shí)造成葡萄酒顏色的損失，不適于單純用于去除酒香酵母污染。

通過調(diào)節(jié)葡萄酒中FSO2的含量來控制葡萄酒中的微生物生長(zhǎng)繁殖是葡萄酒廠常用的方式之一，將葡萄酒中FSO2的含量保持在30 mg/L左右有利于酒香酵母的防控。

綜上所述，用抑制酒香酵母多糖處理葡萄酒和合理控制葡萄酒中FSO2的含量?jī)煞N方法可以達(dá)到防控酒香酵母的目的。

參考文獻(xiàn)

［1］ 曹培鑫, 馬濤, 楊凱迪, 等. 我國(guó)葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的檢測(cè)和鑒定［J］. 食品科學(xué), 2015, 36（23）： 172-177.

［2］ OELOFSE A, PRETORIUS I S，TOIT M D. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking： A synoptic review［J］. S Afr J Enol Vitic, 2008, 29（2）： 128-144.

［3］ 葛有輝, 王德良, 曹健. 富含β-葡萄糖苷酶的酒香酵母在釀酒領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］. 釀酒科技, 2011（2）： 96-99.

［4］ STAPLES E J. Monitoring Brettanomyces in wine aroma with an electronic nose［EB/OL］. http：//www.QASolutionInC.com/ TechPapers/Brett_in_Wine.pdf, 2010.

［5］ 林文華, 游雪燕, 馮濤. 葡萄酒酒香酵母屬不良風(fēng)味抑制的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)釀造, 2013, 3（5）： 5-9.

［6］ 李華. 現(xiàn)代葡萄酒工藝學(xué)［M］. 西安： 陜西人民出版社, 2000：131-133.

［7］ AGNOLICCI M，REA F. Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis［J］. Int J Food Microbiol, 2010, 143（1-2）： 76-80.

［8］ MILLET V, LONVAUD-FUNEL A. The viable but non-cultrable state of wine microorganisms during storage［J］. Letters in Applied Microbiology, 2000, 30（2）： 136-141.

新型薄膜過濾器可保持葡萄酒香氣

在加拿大不列顛哥倫比亞省，曾經(jīng)作為肺科教授的Dick Jones正在研究使白葡萄酒氣味變佳的方法。他已經(jīng)找到了保持芳香化合物的有效方法，可防止發(fā)酵過程中的損失，當(dāng)?shù)鼐茝S對(duì)研究結(jié)果給予關(guān)注。Jones將該設(shè)備稱作“AromaLoc”，是一個(gè)薄膜過濾器，希望明年能夠獲得專利并上市銷售。

Jones出生在美國(guó)，1971年搬到加拿大阿爾伯塔（Alberta），在阿爾伯塔大學(xué)從事肺科教學(xué)35年。2005年，Jones和妻子搬到加拿大奧克納根山谷的納拉馬塔，不久之后便開始利用灰皮諾和佳美葡萄進(jìn)行釀酒。

他非常喜歡葡萄酒的香氣。但他發(fā)現(xiàn)，當(dāng)品嘗成品葡萄酒時(shí)，很多香味都消失了。很多葡萄酒釀酒商一直在保持芳香物質(zhì)方面做努力，例如釀酒過程中采用冷發(fā)酵法或反滲透法，但方法都不太有效。

2012年，Jones讀到了一篇新型膜研發(fā)的報(bào)道。挪威科技大學(xué)（Norwegian University）化學(xué)工程師May-Britt H?gg研發(fā)出一種膜，用于除去燃煤電廠排放的CO2。隨后，他與H?gg聯(lián)系將發(fā)明用于葡萄酒，H?gg對(duì)此非常感興趣。

Jones改進(jìn)并測(cè)試了裝置，它看起來非常簡(jiǎn)單，像一塊平板，有光澤，其實(shí)上面附有無數(shù)個(gè)人眼看不見的微小膜片，比單個(gè)紅細(xì)胞還要薄。在進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵時(shí)，這些膜片允許CO2通過，但芳香物質(zhì)等大分子物質(zhì)則不能通過。Jones把這歸功于他的肺科學(xué)知識(shí)：人體肺部的設(shè)計(jì)就是釋放CO2，把其他物質(zhì)留在其中。

2015年，Jones與潘塔治酒莊（Pentage Winery）莊主Paul Gardner將該設(shè)備第一次用于商業(yè)生產(chǎn)，利用1000 L發(fā)酵罐釀造了700 L灰皮諾葡萄酒。罐頂代替常用的塑料薄膜封閉，改用18英寸長(zhǎng)的橡膠管連接，橡膠管內(nèi)部布有無數(shù)薄膜片，看起來像個(gè)行李箱。

然后，葡萄酒樣品送到哥倫比亞大學(xué)的葡萄酒研究中心（University of British Columbia's Wine Research Centre）進(jìn)行芳香化合物分析。結(jié)果顯示，該葡萄酒中芳香物質(zhì)比其他正常葡萄酒含量高出很多。另一位小組成員Alison Moyes說：“起初我也表示懷疑，但葡萄酒中的芳香物質(zhì)含量差別太明顯了。”

現(xiàn)在AromaLoc專利正在申請(qǐng)，該裝置將于2017年作為商品提供。

來源：http：//www.winespectator.com/（李旋編譯）

Contrast of three methods to remove the effect of Brettanomyces from wine

FU Xiaofang1, WANG Huanxiang1, SHANG Hua1, BAI Youbo1, ZHU Ya'nan1, GAO Chengjun1, ZHAO Xiaoning1, WANG Shengjie2
（1. China Great Wall Wine Co., Ltd. Huailai, Hebei, 075400； 2. COFCO Great Wall Wine （Zhuolu） Co., Ltd. Zhuolu, Hebei, 075600）

Abstract：Brettanomyces is one of the main microbial contamination in winery. They were often been found in the space, equipments and wine. In the fermentation process, Brettanomyces can take advantage of precursor in wine to produce 4-Ethylphenol（ 4-EP） and 4-Ethylguaiacol（4-EG）. At low concentrations those two materials can increase the complexity of wine, while at high concentration give bad taste and disagreeable flavors, and reduce the economic value. By comparison three methods of Brettanomyces control, the result showed that using STAB MICRO and reasonable concentration of free SO2would be effective at reducing the impact of Brettanomyces on wine flavor.

Key words：wine； Brettanomyces； disagreeable flavors； control

中圖分類號(hào)：TS262.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.03.004

收稿日期：2016-03-03

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)勵(lì)性后補(bǔ)助資金項(xiàng)目（15927116H）

作者簡(jiǎn)介：傅曉方（1985-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：葡萄酒釀造。E-mail： fxfmbe@163.com