中藥黃連對(duì)鰱魚消化酶和去毒酶活力及抗MC-LR作用的影響

韓光耀， 畢 瀟， 余 飛， 孔德紅， 朱炎坤， 周 亮， 謝麗玲

(汕頭大學(xué)生物學(xué)系，廣東汕頭 515063)

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中藥黃連對(duì)鰱魚消化酶和去毒酶活力及抗MC-LR作用的影響

韓光耀， 畢 瀟， 余 飛， 孔德紅， 朱炎坤， 周 亮， 謝麗玲*

(汕頭大學(xué)生物學(xué)系，廣東汕頭 515063)

摘要[目的]研究中藥黃連對(duì)鰱魚消化酶和去毒酶活力以及銅綠微囊液MC-LR含量的影響。[方法]將黃連水提液作為飼料添加劑喂喂鰱魚，檢測(cè)鰱魚的腸道消化酶(脂肪酶、胃蛋白酶和淀粉酶)和肝臟去毒酶(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶sGST及其底物谷胱甘肽GSH)活力以及銅綠微囊藻受到抑制后藻毒素MC-LR含量的變化。[結(jié)果]在普通水體中飼養(yǎng)，喂藥組和對(duì)照組各酶活力沒有顯著差異(P>0.05 )；放入銅綠微囊藻藻液飼養(yǎng)24 h后，脂肪酶活力升高，淀粉酶活力降低，差異極顯著 (P<0.01)，但胃蛋白酶活力差異不顯著(P>0.05 )。喂藥組與對(duì)照組腸道消化酶活力差異不顯著 (P>0.05 )；喂藥組鰱魚肝臟GSH和sGST活力升高(P<0.01)，且高于對(duì)照組(P<0.01)。120 h，黃連水提液處理組銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量降低了82.4%，空白組的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量增加了39.5%。[結(jié)論]在飼料中添加黃連鰱魚在銅綠微囊藻環(huán)境下，黃連可誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)鰱魚肝臟去毒酶活力，在富含銅綠微囊藻的水體中飼料中添加黃連鰱魚的生存能力有所提高。

關(guān)鍵詞黃連；MC-LR；消化酶；sGST；GSH

中草藥作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛應(yīng)用，能夠提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。中草藥具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富以及性能多樣等優(yōu)點(diǎn),既能提高水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料利用率,又能防治水產(chǎn)動(dòng)物病害,是其他禁用抗菌素和化學(xué)藥物的替代產(chǎn)品,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注[1]。研究表明，黃連對(duì)非 01 群霍亂弧菌、溫和氣單胞菌、魯氏不動(dòng)桿菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌具有明顯的抑制作用[2]。因此，研究黃連對(duì)魚類消化酶的作用在生理學(xué)具有重大意義。

鰱魚是典型的濾食性魚類，可濾食浮游動(dòng)物和浮游植物，已經(jīng)被用于控制水華污染[3-6]。魚類消化酶主要有蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶等。在有胃魚類胃中的胃蛋白酶活性最強(qiáng)[7]，胃蛋白酶活性可受飼料蛋白質(zhì)的影響[8]。淡水水體中常見的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、水華魚腥藻(Anabaenaflosaquae)、顫藻(Oscillatoria)等是產(chǎn)生微囊藻毒素(Microcystin,MC)的主要藻類，可產(chǎn)生1種或多種藻毒素[9]。水體中最常見的微囊藻毒素是MC-RR、MC-YR和MC-LR，其中MC- LR 毒性大于MC-RR、MC-YR[10]?？扇苄怨入赘孰腟-轉(zhuǎn)移酶催化微囊藻毒素(Microcystins,MCs)與還原型谷胱甘肽GSH的加合去毒代謝過程[11]。濾食微藻的魚類在水華暴發(fā)時(shí)GST基因表達(dá)上調(diào)[12]，sGST活力易受環(huán)境誘導(dǎo)。筆者以鰱魚胃蛋白酶、腸道脂肪酶、淀粉酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(sGST)及其底物還原型谷胱甘肽(GSH)為研究對(duì)象，研究了黃連對(duì)鰱魚消化酶和去毒酶活力以及銅綠微囊藻液MC-LR含量的影響，以評(píng)價(jià)黃連水提液對(duì)鰱魚抗銅綠微囊藻能力的影響，旨在為黃連應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用銅綠微囊藻FACHB-940購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù)；黃連購(gòu)自汕頭市采芝林藥店；試驗(yàn)用鰱魚購(gòu)自汕頭市明記魚苗場(chǎng)。

1.2儀器高效液相色譜儀Agilent 1100，為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，為國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱，為寧波江南儀器廠產(chǎn)品；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)；JFSD-100型粉碎機(jī)，為上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品；DZF-6020型真空干燥箱，為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藻種的培養(yǎng)。將銅綠微囊藻轉(zhuǎn)接到藻類BG11液體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 500 lx，光照周期為12 h∶12 h。所有試驗(yàn)操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3.2黃連飼料的制備。①將黃連研磨成粉(50目)，與蒸餾水按一定比例混合放入圓底燒瓶，80 ℃水浴提取1 h，離心后取上清液，調(diào)整濃度為5 mg/mL，4 ℃下保存?zhèn)溆?。②基礎(chǔ)飼料的制備。將普通顆粒狀飼料機(jī)械研磨成粉狀(50目)，干燥保存?zhèn)溆?。③黃連飼料的制備?；A(chǔ)飼料與蒸餾水等量混合，每克飼料(干重)加入黃連藥液1 mL，使飼料中藥物含量為0.5%，60 ℃下烘干30 min，冷卻后4 ℃保存。

1.3.3鰱魚的飼養(yǎng)。鰱魚先在凈水中馴養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為對(duì)照組和喂藥組，每組鰱魚數(shù)≥50條，按魚體重的3%投喂飼料(干重)分別投喂基礎(chǔ)飼料和黃連飼料。飼養(yǎng)期間保持24 h供氧，每天換1次曝氣12 h的自來水(普通水體)。鰱魚飼養(yǎng)14 d后，將鰱魚放入銅綠微囊藻水體(OD680=0.550)中24 h。夏季每天檢查1次鰱魚體表是否有寄生蟲。通過觀察發(fā)現(xiàn)未投喂飼料時(shí)水體清澈，底層魚糞很少；投喂飼料過夜后，水體透明度下降，底層有大量魚糞。這說明鰱魚對(duì)配制的飼料攝食良好。

1.3.4鰱魚消化酶和去毒酶的活性測(cè)定。

(1)鰱魚腸道消化酶的測(cè)定。普通水體和銅綠微囊藻水體生長(zhǎng)的鰱魚，各組取3條體重約10 g的鰱魚冰浴解剖，取腸道，冰浴研磨，用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定鰱魚胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。每組3個(gè)重復(fù)。

(2)鰱魚肝臟GSH與sGST活性的測(cè)定。鰱魚在普通水體中飼養(yǎng)14 d后，取3條體重約10 g的鰱魚冰浴解剖，取肝臟，冰浴研磨，按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.5銅綠微囊藻MC-LR含量的測(cè)定。采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR的含量。取銅綠微囊藻液30 mL，4 500 r/min離心10 min后收集藻細(xì)胞，用超純水洗滌1次，12 000 r/min離心收集藻細(xì)胞，加入1 mL超純水，沸水浴15 min，12 000 r/min離心10 min后取上清，4 ℃下保存?zhèn)溆?。提取液?.45 μm濾膜過濾，采用HPLC檢測(cè)MC-LR的含量[13]。HPLC條件如下：柱溫40 ℃；標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相為乙腈-0.08%三氟乙酸溶液(42∶58)；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用Excel繪圖，利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析,顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2結(jié)果與分析

2.1黃連飼料添加劑對(duì)鰱魚消化酶活力的影響從圖1～2可以看出，在普通水體條件飼養(yǎng)14 d后，喂藥組與對(duì)照組鰱魚的消化酶活力不存在顯著差異(P>0.05)。將鰱魚放入藻液24 h后，對(duì)照組鰱魚的脂肪酶活力升高了1.99倍，胃蛋白酶活力升高了1.19倍；喂藥組鰱魚的脂肪酶活力則升高了2.58倍，胃蛋白酶活力升高了2.00倍，超過了對(duì)照組的正常水平。對(duì)照組和喂藥組鰱魚的脂肪酶活力顯著升高(P<0.01)，而胃蛋白酶活力無(wú)顯著差異(P>0.05)；對(duì)照組淀粉酶活力下降7.03倍，顯著降低(P<0.05)；喂藥組淀粉酶活力下降了3.43倍，極顯著降低(P<0.01)。這說明黃連飼料能提高鰱魚在微囊藻水體中的脂肪酶和淀粉酶的活力，降低胃蛋白酶的活力。

圖1　黃連飼料對(duì)鰱魚消化酶活力的影響Fig.1　Effects of Coptis chinensis feed on the activity of digestive enzymes of Hypophthalmichthys molitrix

注：*表示存在顯著差異(P<0.05);**表示存在極顯著差異(P < 0.01)。Note:* indicated significant differences (P< 0.05); and ** indicated extremely significant differences (P< 0.01).圖2　黃連飼料對(duì)鰱魚在銅綠微囊藻液中消化酶活力的影響Fig.2　Effects of C.chinensis feed on the digestive enzyme activity of H.molitrix in water body with M.aeruginosa

2.2黃連飼料添加劑對(duì)鰱魚肝臟GSH和sGST活力的影響從圖3和圖4可以看出，在普通水體中，喂藥組鰱魚的GSH和sGST活力均低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。將鰱魚放養(yǎng)在微囊藻藻液24 h后，喂藥組鰱魚的肝臟去毒酶(GSH和 sGST)活力迅速升高。喂藥組GSH活力提高了52.64%，sGST活力提高了34.41%，顯著高于正常飼養(yǎng)期間水平(P<0.01)。對(duì)照組GSH活力下降了6.30%，sGST活力下降了19.67%，均低于正常飼養(yǎng)期間水平，無(wú)顯著差異(P>0.05)。喂藥組鰱魚的GSH和sGST活力顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。這說明在銅綠微囊藻環(huán)境下黃連飼料能夠提高鰱魚GSH和sGST活力。

2.3黃連對(duì)銅綠微囊藻MC-LR含量的影響從圖5可以看出，HPLC檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)MC-LR出峰良好。從圖6可以看出，黃連處理的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量隨著抑制時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，120 h共降低82.4%，差異極顯著(P<0.01)?？瞻捉M銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，120 h MC-LR含量增加了39.5%，差異極顯著(P<0.01)。48～72 h，MC-LR含量有所下降，96 h MC-LR含量與72 h相比下降了2.3%，差異不顯著(P>0.05)。

圖3　黃連飼料對(duì)普通水體中鰱魚的GSH和sGST活力的影響Fig.3　Effects of C.chinensis feed on GSH and sGST activities of H.molitrix in normal water body

注：**表示與對(duì)照組存在極顯著差異(P < 0.01)。Note:** indicated extremely significant differences (P < 0.01).圖4　黃連飼料對(duì)藍(lán)藻水體中鰱魚GSH和sGST活力的影響Fig.4　Effects of C.chinensis feed on the GSH and sGST activities of H.molitrix in water body with M.aeruginosa

注：A：標(biāo)準(zhǔn)品MC-LR；B：空白組細(xì)胞內(nèi)MC-LR；C：藥物組細(xì)胞內(nèi)MC-LR。Note:A.Standard substances MC-LR; B.Intracellular MC-LR of control group,C:Intracellular MC-LR of administration group.圖5　微囊藻毒素MC-LR的HPLC圖譜Fig.5　HPLC of microcystin MC-LR

圖6　黃連對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量的影響Fig.6　Effects of C.chinensis on intracellular MC-LR content of M.Aeruginosa

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明鰱魚在微囊藻水體中的脂肪酶和淀粉酶的活力升高，胃蛋白酶的活力降低。強(qiáng)俊等[14]認(rèn)為飼料中低聚木糖添加量在0.033%左右時(shí)，可以提高奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚的消化酶活力和飼料轉(zhuǎn)化率。胡忠澤等[15]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)草魚生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，可以提高飼料利用率和腸道蛋白酶和淀粉酶的活性。何曉麗等[16]在飼料中添加黃連和大豆，發(fā)現(xiàn)添加0.5%黃連和10%大豆的飼料喂養(yǎng)可以提高雞腸道的蛋白酶和淀粉酶活性，但黃連添加量對(duì)消化酶活力的影響則與該試驗(yàn)結(jié)果并不一致。陸開宏等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鰱魚以水華藍(lán)藻為食，淀粉酶活力通常處于較低水平，與該研究結(jié)果相一致。

吳偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)羅非魚暴露于2.0、3.0、5.0和10.0 μg/L 濃度的溴氰菊酯，其體內(nèi)的GSH含量和GST活力先升高后降低，即先誘導(dǎo)后抑制。王奇等[19]研究發(fā)現(xiàn)羅非魚GST在磺胺藥物誘導(dǎo)下的響應(yīng)敏感。該研究發(fā)現(xiàn)在普通水體中對(duì)照組和喂藥組的鰱魚肝臟GSH含量和sGST活力較低，原因可能是藍(lán)藻濃度極低，對(duì)鰱魚毒性較小，未達(dá)到黃連誘導(dǎo)GSH和sGST的水平。將鰱魚放養(yǎng)在藻液中后，對(duì)照組鰱魚未能快速適應(yīng)環(huán)境的改變，其肝臟GSH含量和sGST活力低于正常飼養(yǎng)期間水平(P>0.05)，而喂藥組鰱魚快速適應(yīng)微藻突然升高的水體環(huán)境，其GSH和sGST活力高于正常飼養(yǎng)期間水平，并高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。這說明在正常飼養(yǎng)期間黃連對(duì)鰱魚有一定的刺激作用，能夠迅速適應(yīng)發(fā)生改變的水體環(huán)境。相對(duì)于在飼料中添加GSH來增強(qiáng)魚的解毒能力[20]，黃連飼料添加劑更具有可行性。

利用化感作用除藻是目前的研究熱點(diǎn)之一。植物中的抑藻物質(zhì)以長(zhǎng)鏈脂肪酸、簡(jiǎn)單酚酸類、酯類和生物堿最為常見?；形镔|(zhì)對(duì)藻類的抑制機(jī)理主要是影響光合作用、破壞細(xì)胞膜、影響酶活性[21-23]。黃連是一種對(duì)大多數(shù)細(xì)菌及藻類具有強(qiáng)烈抑制作用的中藥材，研究人員對(duì)其抑制機(jī)理已有深入研究，如張樹林[24]研究發(fā)現(xiàn)黃連對(duì)銅綠微囊藻的抑制是通過其主要成分生物堿的化感作用完成的,但對(duì)黃連抑制藍(lán)藻后微囊藻毒素的變化尚無(wú)報(bào)道。筆者通過檢測(cè)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR的含量，發(fā)現(xiàn)正常的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷積累，黃連處理的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MC-LR含量隨抑制時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。同時(shí)，黃連抑制120 h后仍然存在完整的藻細(xì)胞，而且離心收集到的藻細(xì)胞顏色發(fā)黃。據(jù)此推測(cè)，黃連抑制葉綠素a使得光合作用受到阻礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

該研究結(jié)果表明黃連飼料能提高鰱魚在微囊藻水體中脂肪酶和淀粉酶的活力，降低胃蛋白酶的活力，能夠促進(jìn)魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，抑制銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)合成MC-LR的含量，提高鰱魚GSH和sGST活力水平，增強(qiáng)了鰱魚抗微囊藻毒素的能力。

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Effects ofCoptischinensison the Digestive Enzymes and Detoxifying Enzymes Activities of and Anti-MC-LR ofHypophthalmichthysmolitrix

HAN Guang-yao,BI Xiao,YU Fei,XIE Li-ling*et al

(Department of Biology,Shantou University,Shantou,Guangdong 515063)

Abstract[Objective] To research the effects of Coptis chinensis on the digestive enzymes and detoxifying enzymes activities of and anti-MC-LR of Hypophthalmichthys molitrix.[Method] Water extracts of C.chinensis were used as a feed additive to feed H.molitrix.Activities of digestive enzymes (lipase,amylase and pepsin) and detoxifying enzymes (glutathione,S-transferase,sGST and its substrate glutathione GSH) were detected,as well as the microcystin MC-LR content change after restriction.[Result] In ordinary water feeding,there was no significant difference (P>0.05) in administration group and control group.After putting Microcystis aeruginosa solution for 24 h,the lipase activity enhanced,but amylase activity reduced.There were extremely significant differences among groups (P < 0.01); but the activity of pepsin showed no significant differences (P > 0.05).There were no significant differences in intestinal digestive enzyme activity between administration group and control group (P > 0.05).Liver GSH and sGST activities in administration group enhanced (P <0.01),which were higher than those in control group (P<0.01). MC-LR content in M.aeruginosa cells in C.chinensis water extract group reduced by 82.4% at 120 h,that in blank group enhanced by 39.5%.[Conclusion] When H.molitrix is fed by C.chinensis under the environment of M.aeruginosa,C.chinensis significantly enhances the liver detoxification enzyme activity of H.molitri; and the viability of C.chinensis improved in water body with M.aeruginosa.

Key wordsCoptis chinensis; MC-LR; Digestive enzymes; sGST; GSH

基金項(xiàng)目廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201005D06-2)；汕頭大學(xué)校內(nèi)科研基金項(xiàng)目(NFC14003);大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2012009)。

作者簡(jiǎn)介韓光耀(1990- )，男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)。*通訊作者，副教授，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號(hào)S 816.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)10-144-04