石榴籽油對雌激素相關的骨質疏松癥小鼠骨量的影響及分子機制的研究

許文勝 康文磊 陳永軍 楊增華 張 濤

作者單位：014010 內蒙古包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨三科

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石榴籽油對雌激素相關的骨質疏松癥小鼠骨量的影響及分子機制的研究

許文勝 康文磊 陳永軍 楊增華 張 濤

作者單位：014010 內蒙古包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨三科

【摘要】目的 觀察石榴籽油對雌激素相關的骨質疏松癥小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微結構的影響，觀察相關細胞的形態(tài)學變化，分析探討其作用機制。方法 將30只雌性KM小鼠按體重隨機分為3組：空白對照組、實驗對照組、實驗組，除空白對照組實施假手術外，其余2組全部在麻醉下切除卵巢制作成骨質疏松癥模型，分別給實驗對照組和實驗組喂食普通飼料和添加一定劑量的石榴籽油的飼料，4周后擬對小鼠股骨近端骨小梁微結構進行檢測。同時對4周后3組動物采血獲得其血清，利用體外血清培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，研究3組動物血清對成骨細胞和破骨細胞相關基因表達的影響。結果 實驗對照組動物股骨近端骨小梁微結構破壞程度最為嚴重，其次為實驗組，空白組骨小梁微結構正常；石榴籽油代謝物（CLA9C）抑制RANKL誘導破骨細胞的分化，通過增加堿性磷酸酶（ALP）活性和基質礦化促進成骨，同時，主要的轉錄水平（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN and成骨細胞標記物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈現(xiàn)上調。結論 石榴子油可以抑制雌激素相關的骨質疏松癥骨量的丟失同時可以促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞活性。

【關鍵詞】石榴籽油；雌激素相關骨質疏松癥；骨量的影響；分子機制

近年來，有關石榴食用和藥用價值的研究越來越為人們所關注，石榴籽油富含不飽和脂肪酸-石榴酸，具備多種藥理功能，本研究旨在觀察石榴籽油對雌激素相關的骨質疏松癥小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微結構的影響，觀察相關組織形態(tài)學變化，分析探討其作用機制，為預防和治療女性絕經(jīng)后骨質疏松癥提供安全、經(jīng)濟、有效的食物或藥物做初步探討。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型、分組和膳食干預

將30只雌性KM小鼠按體重隨機分為3組：空白對照組、實驗對照組和實驗組，除空白對照組實施模擬手術外，其余2組全部在麻醉下切除卵巢制作成骨質疏松癥模型，給模擬組和實驗組喂食普通飼料和添加5%石榴籽油的飼料，4周后麻醉下處死小鼠，取出雙側股骨加以檢測分析。

1.2 組織形態(tài)學檢測

對實驗動物股骨近端進行5 μm厚非脫灰組織切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）進行染色。形態(tài)學計量用與光學纖維鏡相連的半自動顯微圖像分析儀（型號：TRH-JX2000A/B），對股骨近端二次海綿骨組織構造，進行定量分析，內容包括骨的骨量/組織量、骨小梁厚度和骨小梁間距，并對酒石酸抵抗性酸性磷酸酶陽性多核破骨細胞的數(shù)目進行測定。

1.3 模型動物體外血清實驗

將30只8周齡的KM小鼠（購自內蒙古大學實驗動物中心）經(jīng)過1周的適應性喂養(yǎng)，隨機分為2組（n=15），一組是PSO組，另一組是普通對照組，PSO組每天的灌胃劑量為200 μg，對照組使用相同的劑量，10 d后，麻醉下心臟抽血離心（3 000 r/min，5 min室溫），去上清液，與同一組動物血清混合，過濾45 μm，分裝并儲存在-80℃直到細胞使用到培養(yǎng)基為止。

以最適濃度的NF-k B受體活化因子配體（RANKL）作為誘導劑，在體外細胞培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7細胞分化為破骨細胞，待破骨細胞分化成熟后，通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法進行破骨細胞鑒定，并采用real-time PCR方法檢測各不同處理組之間，破骨細胞表型基因及功能基因NF-κB受體活化因子（RANK）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、破骨細胞降鈣素受體（CTR）、組織蛋白酶K（CTSK）、趨化因子受體CCR2和整合素基因β3 （ITG-β3）的mRNA表達的差異。經(jīng)過體外特定培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠前成骨細胞MC3T3-E1，檢測細胞的增殖及基因的表達量，對骨堿性磷酸酶（ALP）、骨保護素基因（OPG）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、盤狀結構域受體2（DDR2）、Ⅰ型膠原蛋白（Coll1a1）進行檢測。

2 結果

詳見圖1～2。

3 討論

絕經(jīng)后骨質疏松癥（POP）是老年婦女的常見病和多發(fā)病，是以骨量減少，骨小梁微結構破壞，脆性骨折風險性增加為主要特征的全身性骨骼系統(tǒng)疾?。?］。絕經(jīng)后婦女的卵巢功能減退，骨組織失去雌激素的保護作用，使骨轉換率升高，骨吸收增多，骨丟失加速，此過程可持續(xù)5～10年，尤以絕經(jīng)后的前3年骨丟失速度最快。當絕經(jīng)后婦女的骨量減少，骨密度（BMD）值低于骨峰值2.5標準差（SD）以上即為絕經(jīng)后骨質疏松，因此雌激素缺乏是骨丟失加快的重要因素。

3.1 雌激素通過受體調節(jié)機制發(fā)揮直接作用

一方面促進成骨細胞增殖和膠原合成以及與骨礦化相關蛋白的合成，另一方面抑制破骨細胞功能活性，并誘導其凋亡［2］，抑制破骨細胞的形成與骨吸收之間的平衡，此外，雌激素還通過鈣代謝激素調節(jié)系統(tǒng)影響3種鈣代謝激素的分泌；雌激素還可通過下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)調節(jié)雌激素及受體的合成。通過上述3條途徑，雌激素能防治絕經(jīng)后骨質疏松癥。

3.2 植物性雌激素防治骨質疏松的作用

植物雌激素防治骨質疏松作用機制已經(jīng)研究到分子水平［3］，主要有以下5個方面。（1）ER基因組作用機制：植物雌激素主要通過結合并激活ERα和ERβ發(fā)揮骨保護作用，對ERβ的親和力高于ERα［4］；（2）ER非基因組作用機制：植物雌激素激活細胞膜ER引起細胞內信號途徑的激活，如磷脂酶C有絲分裂原激活蛋白激酶（MAP K）的激活；（3）過氧化物酶增殖子激活受體介導機制：過氧化物酶增殖子激活受體（PPARs）是植物雌激素關鍵性的轉錄靶受體，也屬于核受體超家族，有α、γ和δ（或β）3種亞型，植物雌激素低濃度時以ER介導的作用為主，表現(xiàn)為骨生成增加、脂肪生成減少；高濃度時以PPARγ介導的作用為主，表現(xiàn)為脂肪生成增加、骨生成減少；（4）OPG/RANKL/ANK介導機制［5］：護骨素（OPG）、核因子-κB（受體活化因子RANK及其配體RANKL（RANK ligand）在破骨細胞的生成激活和存活中起重要作用，成骨細胞在骨微環(huán)境中對破骨細胞的整體功能發(fā)揮直接作用，包括對OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的調節(jié)，植物雌激素可能通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)產生骨保護作用；（5）酶抑制作用機制：已證實異黃酮類是一種酪氨酸激酶抑制劑，介導細胞內鈣離子信號途徑，抑制蛋白激酶和酪氨酸激酶，從而引起破骨細胞凋亡抑制骨吸收，也可以通過抑DNA拓撲異構酶I的活性來減少破骨細胞形成。

圖1 3組動物股骨近端骨小梁微結構變化比較

圖2 對特定細胞因子蛋白表達的調節(jié)作用

3.3 石榴籽油的結構與理化特性

石榴籽油（PSO）是唯一植物來源的多不飽和共軛脂肪酸，由石榴籽通過化學工藝萃取而來，其主要含有六種脂肪酸：石榴酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等。而石榴酸是石榴籽油的最主要成分，約占86%。石榴酸的分子結構見圖3。

圖3 石榴酸分子結構

因石榴酸的結構與共軛亞油酸（CLA）最為接近而將其稱為”超級共軛亞油酸”，近些年國內外研究表明，石榴籽油具有多種藥理作用，包括抗氧化、清除自由基和抗衰老；抗基因突變與抗癌作用；降低血壓、血糖、血脂和抗動脈粥樣硬化的功能；雌激素樣作用；抗腹瀉、抑制大腸桿菌等致病菌的生長及其腸毒素的產生等；其中雌激素樣作用在動物實驗研究方面表明［6］，以含石榴提取物的溶液喂飼卵巢切除的大鼠，更年期癥狀得到有效緩解，即大鼠的增重得到控制，子宮重量有所增加，骨質流失受到抑制，抑郁癥狀減輕，更年期的持續(xù)時間縮短，各項骨骼組織參數(shù)均接近正常大鼠的水平。石榴緩解更年期綜合癥的作用與其所含類雌激素物質具有參與脂代謝、保留骨質、增強中樞腎上腺系統(tǒng)的功能和類雌激素樣作用有關。

3.4 石榴籽油對雌激素相關的骨質疏松癥小鼠骨量的影響

石榴富含類固醇激素和植物雌激素，其中植物雌激素對人體具有雙向調節(jié)作用，即當體內雌激素水平較低時，它們直接與雌激素受體結合發(fā)揮雌激素效應；當體內雌激素水平較高時，它們與雌醇競爭性結合雌激素受體，從而表現(xiàn)出抗雌激素作用。雌激素能促進成骨細胞中TGF-β的產生，表明這些生長因子對骨形成有促進作用，雌激素通過這些生長因子的產生，促進骨形成［7］。實驗表明［8］，當雌激素缺乏，骨髓單核細胞分泌IL-1和間質細胞分泌IL-6都增多，切除卵巢的患者體內TNF-α和GM-CSF水平升高，接受雌激素治療的患者TNF-α和GM-CSF恢復到正常水平。以上細胞因子對骨吸收過程有促進作用，雌激素通過抑制上述細胞因子的產生而抑制骨吸收。骨密度是用單位面積或體積內的礦物質含量來表示骨密度測定是直接反映骨礦物質丟失的敏感指標，其在骨量丟失5%時雙能X線骨密度儀即可檢出。本實驗小鼠股骨近端進行5 μm厚非脫灰組織切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）進行染色。形態(tài)學計量用與光學纖維鏡相連的半自動圖像分析儀，對股骨近端二次海綿骨組織構造，進行定量分析表明，石榴籽油具有抑制雌激素相關的骨質疏松癥小鼠骨量減少的作用，其抑制骨量減少的作用機制可能與促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞增殖有關。

3.5 石榴籽油抑制骨質疏松癥小鼠骨量的丟失分子機制的探討

Ahmed等研究發(fā)現(xiàn)石榴果提取物可抑制軟骨外植體中白介素-1β誘導的蛋白多糖的分解。6.25～25 mg、L的石榴果實提取物即可在細胞水平上將白介素-1β誘導的基質金屬蛋白酶MMP-1，MMP-3，MMP-13蛋白的表達水平抑制到中等水平［9］。本研究表明，給骨質疏松癥小鼠喂食5%石榴籽油飼料，4周后采血，利用體外血清培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，研究石榴籽油對成骨細胞和破骨細胞相關基因表達的影響。結果表明：石榴籽油可能通過下調破骨細胞的基因表達抑制破骨細胞的活性。在體外血清試驗中，通過檢測特定破骨細胞分化標記物的表達（MMP9，CTR，和TRAP等）進一步驗證了石榴籽油代謝物（CLA9C）抑制RANKL誘導的破骨細胞分化是通過下調其特定地基因來實現(xiàn)的，另一方面，對成骨細胞胚胎前體的MC3T3-E1細胞加以培養(yǎng)，通過增加堿性磷酸酶（ALP）活性和證明基質礦化來推測石榴籽油血清能促進成骨，同時，主要的轉錄水平因子（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN 和成骨細胞系標記物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈現(xiàn)上調的結果。在培養(yǎng)體系中加入不同比例的石榴籽油和玉米油，通過檢測RAW264.7細胞分化因子MMP9，CTR，ITG β3，RANK-RANKL的表達以及MC3T3-E1細胞DDR2，Coll1a1，BSP等的表達證實了石榴籽油對特定細胞因子蛋白的表達具有調節(jié)作用。

綜上所述，石榴籽油作為石榴果實的重要組成部分，對雌激素相關的骨質疏松癥骨量丟失方面具有抑制作用。同時石榴籽油作為一種天然果實成分，有可能成為女性絕經(jīng)后防治骨質疏松癥方面安全、有效而經(jīng)濟的食品或藥物之一。

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Molecular Mechanism for Pomegranate Seed Oil Prevents Bone Loss in A Mice Model of Osteoporosis Through the Regulation of Estrogen

XU Wensheng KANG Wenlei CHEN Yongjun YANG Zenghua ZHANG Tao Department of Third Osteology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Baotou Medical，Baotou 014010，China

【Abstract】

Objective To study the molecular mechanism for pomegranate seed oil in prevention of bone loss in a osteoporosis mice model. Methods Accordded to the weight randomly divided 30 KM female mice into 5 groups: pomegranate seed oil low，medium and high dose group，normal group，model group，after 4 weeks detected the bone density，mineral structure and affect on uterus. Results Bone mineral density test show that low doses ofpomegranate seed oil obvious decreased estrogen caused by a lack of BMD，middle dose of pomegranate seed oil completely inhibit the decline，high does of pomegranate seed oil compared with normal group，significantly increased bone mineral density，low doses of pomegranate seed oil significantly suppressed spongy bone bone loss，bone trabecular width decreased and the increase of bone trabecular spacing and was completely inhibited by middle dose of pomegranate seed oil，and high doses of pomegranate seed oil significantly increased bone mass and bone trabecular width. Mild，high doses of pomegranate seed oil inhibits a drop in the quality of the uterus. Conclusion Pomegranate seed oil can inhibit bone loss of estrogen related osteoporosis and can promote osteoblast differentiation at the same time，inhibit the osteoclast activity.

【Key words】Pomegranate seed oil，Osteoporosis regulation of estrogen，Prevents bone loss，Molecular mechanism

基金項目：包頭市社會發(fā)展科技支撐項目（編號：2014S2003-5-12） 內蒙古自治區(qū)自然科學基金項目（編號：2014MS0812）

【中圖分類號】R3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）03-0187-03

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.03.138