環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條可視化檢測哈維氏弧菌的研究

程蝶 柴方超 蔡怡 周前進 陳炯

（寧波大學生物與海洋科學系，寧波 315211）

環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條可視化檢測哈維氏弧菌的研究

程蝶 柴方超 蔡怡 周前進 陳炯

（寧波大學生物與海洋科學系，寧波 315211）

以哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）為材料，利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）進行核酸擴增，借助橫向流動試紙條（LFD）完成產(chǎn)物檢測，旨在建立一種可用于哈維氏弧菌快速檢測的LAMP-LFD新技術(shù)。以哈維氏弧菌的溶血素基因（vhhA）為檢測靶標設(shè)計了3對特異性引物（其中，上游內(nèi)引物vhhA-FIP由生物素標記），進行由生物素標記的LAMP反應(yīng)；同時設(shè)計1條異硫氰酸熒光素（FITC）標記的探針，與獲得的LAMP產(chǎn)物進行特異性雜交，雜交產(chǎn)物經(jīng)LFD完成檢測。經(jīng)優(yōu)化，LAMP的反應(yīng)條件為63℃反應(yīng)40 min，由LFD完成結(jié)果判讀共需50 min。結(jié)果表明，LAMP-LFD方法能特異性地檢出哈維氏弧菌，對創(chuàng)傷弧菌等其他9種水產(chǎn)養(yǎng)殖重要病原菌的檢測結(jié)果呈陰性。利用該方法，針對細菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為1.0×102CFU/mL或2 CFU/反應(yīng)，針對污染有該菌的大黃魚組織的檢測靈敏度為5×102CFU/mL或20 CFU/反應(yīng)，均是以LAMP外引物vhhA-F3/vhhA-B3的常規(guī)PCR方法的100倍。因此，該方法能夠快速、準確地檢出哈維氏弧菌，有望在海水養(yǎng)殖過程哈維氏弧菌的監(jiān)測和即時檢測中普及使用。

哈維氏弧菌；溶血素基因；環(huán)介導等溫擴增技術(shù)；橫向流動試紙條；檢測

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是一種革蘭氏陰性的嗜鹽弧菌，普遍分布于近岸的海水環(huán)境中，是海洋水體和許多海生動物的正常菌群［1，2］。同時，哈維氏弧菌又是一種重要的機會致病菌，可感染魚、蝦、貝類等多種海洋動物，引發(fā)死亡率較高的弧菌?。?］。在東南亞地區(qū)，哈維氏弧菌是蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要細菌性病害之一［4，5］；該弧菌也曾給大洋洲各國斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖帶來毀滅性的打擊［6，7］。哈維氏弧菌可使鮑魚養(yǎng)殖大面積減產(chǎn)，該菌感染被認為是自1998年以來法國養(yǎng)殖和野生的歐洲鮑螺出現(xiàn)季節(jié)性大面積死亡的主要原因［8］。在我國，蝦的早期死亡綜合征（early mortality syndome，EMS）已成為蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要掣肘［9］，而研究表明哈維氏弧菌即是該新發(fā)病的主要細菌性病原之一［9，10］，同時也是對蝦白尾病的重要誘因［11］。此外，該病原也是我國多種養(yǎng)殖魚類、貝類和蟹類的重要病原［12-15］。

哈維氏弧菌與其他多種致病弧菌（如副溶血弧菌、溶藻弧菌等）在表型和基因型非常相似［16］，這給種型水平上細菌的鑒定帶來了一定的困難。例如，利用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定或借助鑒別培養(yǎng)基不能將哈維氏弧菌與其他弧菌進行有效區(qū)分，而16S rRNA的序列分析也只能將其鑒定至科屬水平［17，18］。基于多位點序列分析（MLSA）或基因組測序的方法可有效區(qū)分不同弧菌，但僅限于實驗室的弧菌分類學研究［18，19］。因此，許多研究致力于哈維氏弧菌其他標志性基因的鑒定和篩選，并在此基礎(chǔ)上建立了多種快速檢測方法，如聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）［20，21］、多重PCR技術(shù)［22，23］、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等［24，25］。這些方法因其高靈敏度和特異性、檢測快速等特點，在哈維氏弧菌的檢測領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。但是，在對這些方法獲得的產(chǎn)物進行檢測分析時，要么通過瓊脂糖凝膠電泳的方式完成，需要接觸EB等有毒試劑，要么借助于熒光染料，容易造成結(jié)果的假陽性。LAMP-LFD技術(shù)是將LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物與特異性的探針雜交，在橫向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD）以顯色的方式呈現(xiàn)實驗結(jié)果，通過肉眼即可快速完成結(jié)果判讀。該方法完全摒棄了EB等有毒試劑，也擺脫了對電泳裝置和凝膠成像系統(tǒng)等的依賴，整個檢測時程也僅在LAMP反應(yīng)的基礎(chǔ)上增加了8-10 min，而且由于特異性探針的引入，使得結(jié)果更加特異，因此，在微生物的基層檢測和現(xiàn)場快速檢測中展現(xiàn)了重大潛力。目前，該技術(shù)已成功運用于傳染性脾腎壞死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）、傳染性肌肉壞死病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV），以及創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）等水產(chǎn)病原微生物的檢測［26-28］。本研究根據(jù)哈維氏弧菌溶血素基因vhhA的保守區(qū)設(shè)計多條引物和1條異硫氰酸熒光素標記的探針，條件優(yōu)化后建立LAMP-LFD檢測方法，并通過少量的樣本檢測，分析該方法在實際檢測應(yīng)用中的可行性，為哈維氏弧菌引發(fā)的弧菌病的快速診斷和早期檢測提供更加可靠、便捷的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda MCCC235）中國海洋微生物菌種保藏管理中心；創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus ATCC 27562）、哈維氏弧菌（V. harveyi ATCC 33866）、河流弧菌（V. fluvialis ATCC 33809）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila ATCC 7966）購自中國普通微生物菌種保藏中心；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 19115）購自廣東省微生物菌種保藏中心；副溶血弧菌（V. parahaemolyticus ATCC 33847）由浙江省疾控中心張嚴峻研究員惠贈；海豚鏈球菌（Streptococcus iniae ATCC 29178）、 溶 藻 弧 菌（V. alginolyticus ATCC 17749）購自美國菌種保藏中心；鰻弧菌香魚分離株（V. anguillarum ayu-H080701）由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)和基因組DNA的制備 研究涉及的弧菌劃線接種于TCBS固體培養(yǎng)基，28-30℃培養(yǎng)12-24 h后，挑取單菌落于堿性蛋白胨水中震蕩培養(yǎng)至所需濃度；遲緩愛德華菌、嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌，以及單增李斯特菌劃線接種于LB或BHI固體培養(yǎng)基，30或37℃培養(yǎng)后，挑取單菌落于LB或BHI液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至所需濃度。

細菌基因組DNA的制備參考王耀煥等［28］的方法，具體操作：取新鮮培養(yǎng)的細菌液體培養(yǎng)懸液1mL 12 000 r/min離心2 min，棄上清；菌體沉淀使用100 μL的細菌裂解液（Tris-HCl 0.1 mol/L，蛋白酶K 0.2 μg/μL，Triton X-100 2.0%）充分懸浮，沸水浴10 min，立即冰浴7 min；重復(fù)上一步操作1次；12 000 r/min離心2 min，取上清定容至100 μL，-30℃貯存，用作LAMP和PCR擴增的模板。

1.2.2 引物設(shè)計 選擇NCBI上公布的哈維氏弧菌溶血素（vhhA，登錄號：AF293430）基因，通過序列比對分析后，依次選擇8個高度保守的基因區(qū)段設(shè)計3對特異性引物（外引物vhhA-F3和vhhA-B3、內(nèi)引物vhhA-FIP和vhhA-BIP、環(huán)引物vhhA-LF和vhhA-LB）用于LAMP反應(yīng)；同時設(shè)計1條探針vhhA-HP，可與LAMP產(chǎn)物進行特異性雜交，用于LFD檢測（表1，圖1）。其中，內(nèi)引物vhhA-FIP的5'端進行生物素標記，探針vhhA-HP的5'端進行異硫氰酸熒光素標記。上述引物和探針由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。另外，將外引物vhhA-F3和vhhA-B3也作為PCR擴增的特異性引物，擴增的預(yù)期片段大小約為310 bp。

表1 根據(jù)哈維氏弧菌vhha基因序列設(shè)計的LAMP-LFD擴增引物序列和探針

圖1 哈維氏弧菌溶血素基因vhhA LAMP-LFD引物序列和探針設(shè)計示意圖

1.2.3 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化 LAMP反應(yīng)的體系參考Ding和王耀煥等［26，28］的方法，具體組成如下（25 μL）：MgSO46.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），Triton X-100 0.1%，甜菜堿 1.6 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物vhhA-F3和vhhA-B3各0.2 μmol/L，內(nèi)引物vhhA-FIP和vhhA-BIP各1.6 μmol/L，環(huán)引物vhhALF和vhhA-LB各0.4 μmol/L，Bst DNA聚合酶（New England BioLabs，美國）8 U，哈維氏弧菌基因組DNA模板 2 μL。陰性對照不加任何模板DNA。

取新培養(yǎng)的哈維氏弧菌，經(jīng)平板計數(shù)法獲得菌液濃度為2.4×108CFU/mL，使用液體培養(yǎng)基（堿性蛋白胨水）將該菌液濃度調(diào)整為1.0×108CFU/mL，并定為起始濃度。將該原始菌液進行連續(xù)10倍濃度梯度稀釋，獲得1.0×108CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.0×106CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×104CFU/mL、1.0×103CFU/mL、1.0×102CFU/mL和1.0×101CFU/mL等8個濃度的菌液，按1.2.1所述的方法分別提取其基因組DNA。選擇較低模板濃度（相當于1.0×104CFU/mL），分別在61、63和65℃條件下溫育 60 min，每個溫度下，平行制備3個樣品，然后經(jīng)80℃熱激5 min終止反應(yīng)，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，確定LAMP的最佳反應(yīng)溫度。選擇2個濃度的菌液（較高模板濃度相當于1.0×108CFU/mL，較低模板濃度相當于1.0×104CFU/mL）作為反應(yīng)時間優(yōu)化的模板，在優(yōu)化的溫度下進行溫育，溫育時間分別為0、10、15、20、25、30、40和50 min，通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4 利用橫向流動試紙條（LFD）檢測 本研究使用的橫向流動試紙條（LFD）購自Milennia Biotec GmbH（Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec GmbH，Germany，http://www.milenia-biotec.de/）， 其檢測線位置標記有生物素抗體，可特異性地與生物素標記的LAMP產(chǎn)物結(jié)合而在檢測線上呈現(xiàn)顏色變化。內(nèi)引物vhhA-FIP經(jīng)生物素標記后，利用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系進行LAMP反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后不使用高溫致使反應(yīng)終止，而是向反應(yīng)體系中20 pmol的經(jīng)FITC標記的探針vhhA-HP，繼續(xù)反應(yīng)5 min；取5 μL反應(yīng)液加入到100 μL 檢測buffer中混勻；將LFD試紙條的檢測端豎直浸入buffer溶液中，靜置3-5 min，肉眼判斷結(jié)果。

1.2.5 LAMP-LFD的特異性實驗 用于LAMP-LFD特異性實驗的細菌種類主要包括弧菌（創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌）、遲緩愛德華菌、單增李斯特菌、海豚鏈球菌，以及嗜水氣單胞菌等9種水產(chǎn)養(yǎng)殖或水產(chǎn)品中的常見病原菌。將各菌株的新培養(yǎng)物調(diào)整濃度至1×105CFU/mL，按

1.2.1 所述提基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，進行有生物素標記的LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測；同時利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳的方法判斷實驗結(jié)果。

1.2.6 LAMP-LFD的靈敏度實驗 分別取1.2.3所述的不同稀釋濃度的哈維氏弧菌菌液提取的基因組DNA 2 μL為模板，每個濃度平行制備3個樣品。利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進行有生物素標記的LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測；同時利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳的方法判斷實驗結(jié)果。

同樣，取上述各稀釋度的基因組DNA為模板，以外引物vhhA-F3和vhhA-B3作為引物，進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（25 μL），包括：10× PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）（TaKaRa，日本）0.15 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，vhhA-F3（10 pmol/μL）1 μL，vhhA-B3（10 pmol/μL）1 μL，基因組DNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后，72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 LAMP-LFD的重復(fù)性實驗 取1 mL新鮮培養(yǎng)的哈維氏弧菌菌液，計數(shù)并調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL，連續(xù)10倍濃度梯度稀釋至LAMP-LFD檢測的最低濃度，平行制備3個樣品。按1.2.1所述提取基因組DNA，并以此為模板，采用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進行擴增，驗證方法的可重復(fù)性。

1.2.8 哈維氏弧菌人工污染大黃魚組織實驗及田間樣本的檢測 取1 mL新鮮培養(yǎng)的哈維氏弧菌菌液，計數(shù)并調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL，10倍濃度梯度稀釋后，選取濃度1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102及1.0×101CFU/mL的菌液各1 mL與等體積的大黃魚肌肉組織勻漿液混勻。每個濃度平行制備3個樣品。取1 mL細菌污染的肌肉組織樣品，采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司，中國）提取細菌污染樣品的基因組DNA，溶解于50 μL的ddH2O中，用作LAMP和PCR測試的模板。健康大黃魚的肝臟組織勻漿液作陰性對照。

收集具有一定臨床癥狀的養(yǎng)殖動物22份，包括大黃魚樣品8份，南美白對蝦14份。首先對各樣品進行細菌分離，通過鑒別培養(yǎng)基篩選結(jié)合生化實驗的方法對病原進行分離、鑒定；同時分別取適量動物組織，利用動物組織基因組DNA提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司，中國）提取基因組DNA，采用LAMP-LFD和PCR方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴增條件的確定

為確定最佳反應(yīng)溫度，以較低濃度的基因組DNA為模板，分別選擇61、63及65℃進行LAMP反應(yīng)60 min。結(jié)果表明，利用上述3個溫度獲得的LAMP產(chǎn)物均能夠檢測到明顯的梯狀條帶，未添加DNA模板的反應(yīng)管未檢測到明顯的梯狀條帶。其中，在相同的反應(yīng)體系下，當反應(yīng)溫度為63℃時，擴增產(chǎn)物的條帶更加清晰，所以選擇63℃作為LAMP反應(yīng)的最適溫度（圖2-A）。

當模板濃度較高時（1.0×108CFU/mL），反應(yīng)15 min即可出現(xiàn)明顯的梯狀條帶；反應(yīng)至30 min時，擴增產(chǎn)物的濃度幾乎不再增加（圖2-B）。當選用較低模板濃度時（1.0×104CFU/mL），反應(yīng)至20 min時，利用瓊脂糖凝膠電泳才可明顯地檢測到梯狀條帶；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，擴增產(chǎn)物的濃度逐漸增加；反應(yīng)時間延長至40 min時，產(chǎn)物濃度不再明顯變化。為保證實際檢測過程中，當遇到較低模板濃度時，仍可有效地檢測出病原，我們將LAMP反應(yīng)的最佳時間確定為40 min（圖2-C）。

圖2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2 LAMP-LFD的特異性

選擇常見的水產(chǎn)致病菌為模板進行LAMP-LFD方法的特異性分析，按優(yōu)化的LAMP反應(yīng)條件63℃溫育40 min。產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測發(fā)現(xiàn)，以哈維氏弧菌基因組DNA為模板的反應(yīng)呈陽性，而以其他供試弧菌、海豚鏈球菌、單增李斯特菌等致病菌的基因組DNA為模板時，反應(yīng)皆呈陰性，以蒸餾水為模板的反應(yīng)也呈陰性（圖3）。

圖3 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）特異性分析

2.3 LAMP-LFD的靈敏度驗證

選 用 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102及1.0×101CFU/mL等7個濃度的基因組DNA作為模板，進行有生物素標記的LAMP反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，經(jīng)LFD檢測的最低模板濃度為1.0×102CFU/mL或2 CFU/反應(yīng)（圖4-E）；利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳同樣可檢測到的最低模板濃度為1.0×102CFU/mL（圖4-A、4-B、4-C）；而以vhhA-F3和vhhA-B3為特異性引物的PCR方法能夠檢測到的最低模板濃度為1.0×104CFU/mL或200 CFU/反應(yīng)（圖4-D）。

2.4 LAMP-LFD重復(fù)性分析

重新取哈維氏弧菌的新鮮培養(yǎng)懸液，調(diào)整至可檢測的最低模板濃度（1.0×102CFU/mL），提取基因組DNA后，以優(yōu)化的反應(yīng)體系63℃溫育40 min。結(jié)果表明，以1.0×102CFU/mL濃度的哈維氏弧菌基因組DNA為模板時，LFD檢測結(jié)果呈陽性；以蒸餾水為模板時，檢測結(jié)果均呈陰性，具有良好的重復(fù)性。

2.5 LAMP-LFD檢測哈維氏弧菌人工污染大黃魚組織靈敏度及適用性分析

不同濃度的哈維氏弧菌等體積污染大黃魚組織發(fā)現(xiàn)，LAMP-LFD可從1.0×103CFU/mL污染的大黃魚肌肉組織中穩(wěn)定檢測到病原，檢測靈敏度為5×102CFU/mL或20 CFU/反應(yīng)。PCR方法只能從1.0×105CFU/mL污染的大黃魚肌肉組織中穩(wěn)定檢測到病原（表2）。LAMP-LFD對健康大黃魚肌肉組織的檢測結(jié)果為陰性，特異性良好。

利用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)方法對收集的病樣檢測表明，8份大黃魚樣品中有2份樣品中可成功分離出哈維氏弧菌，而14份南美白對蝦中有4份樣品分離出哈維氏弧菌。利用LAMP-LFD方法從傳統(tǒng)方法鑒定陽性的樣品中均可檢測出哈維氏弧菌，而且從傳統(tǒng)方法鑒定陰性的2份病蝦樣品中檢測到哈維氏弧菌的存在；PCR方法也能夠從傳統(tǒng)方法鑒定陽性的樣品中檢測出哈維氏弧菌，而傳統(tǒng)方法檢測陰性的1份病蝦樣品中檢測到該病原菌（表3）。

3 討論

哈維氏弧菌能夠感染多種海洋脊椎動物和無脊椎動物，而在我國，該病原已成為對蝦養(yǎng)殖中的主要病原菌，也是魚類、貝類及蟹類養(yǎng)殖的重要細菌性病原。因此，建立快速、準確的檢測技術(shù)，實現(xiàn)病原菌的早期診斷和基層的即時檢測，對于該病的有效預(yù)防和監(jiān)測具有重要意義。本研究選擇哈維氏弧菌的溶血素基因作為檢測靶標，建立了便捷的LAMP-LFD技術(shù)，可特異性的從細菌培養(yǎng)物或動物組織樣品中檢測到哈維氏弧菌病原。

圖5 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）的重復(fù)性試驗

表2 哈維氏弧菌人工污染健康大黃魚肌肉組織的檢測結(jié)果

表3 細菌分離培養(yǎng)、LAMP-LFD和PCR對野外病樣的檢測結(jié)果

靈敏度是衡量核酸檢測類方法的重要技術(shù)指標。Pang等［29］選擇toxR作為分類標記，建立的PCR方法，可從4.0×103細菌/mL的哈維氏弧菌純培養(yǎng)物中檢測到細菌的存在；Caipang等［21］以熱激蛋白家族dnaJ基因為檢測靶標，建立了可特異性檢測亞洲鱸魚體內(nèi)哈維氏弧菌感染的PCR方法，檢測靈敏度達到了100 fg的細菌基因組DNA。而Schikorski等［20］基于TaqMan探針技術(shù)建立了實時熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用于歐洲鮑魚哈維氏弧菌的檢測，靈敏度可達18 個細菌。多重PCR技術(shù)在哈維氏弧菌和弧菌菌群其他弧菌的同步檢測和鑒別中取得了一定程度的應(yīng)用。Cano-Gomez等［22］建立的多重PCR技術(shù)，應(yīng)用于哈維氏弧菌與相似弧菌坎氏弧菌（V. campbellii）、藻弧菌（V. owensii）、輪蟲弧菌（V. rotiferianus）的區(qū)別鑒定，檢測靈敏度可達到30 pg的細菌基因組DNA。而Haldar等［23］選擇弧菌的溶血素基因建立的多重PCR技術(shù)，可分別特異性地檢出哈維氏弧菌、坎氏弧菌，以及副溶血弧菌，最低檢測下限在10-100個細菌。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)被認為具有比PCR更加優(yōu)越的靈敏度［30］。Cao等［24］將毒素調(diào)控基因（toxin-positive regulatorygene，toxR）作為檢測靶標，建立了針對哈維氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，靈敏度為17.2 個細菌，與基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR技術(shù)的檢測靈敏度相當。而Thongkao等［25］基于vhhP2基因建立的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，進一步將該方法的靈敏度提高到了0.6 CFU。本研究建立的LAMP-LFD方法，針對哈維氏弧菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為1.0×102CFU/mL或2 CFU/反應(yīng)；而利用該方法能夠從污染強度達到5×102CFU/mL的大黃魚組織中穩(wěn)定檢測到哈維氏弧菌的存在，具有良好的靈敏度。

操作便捷，檢測快速是目前核酸檢測類方法不斷改進的重要目標。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)因其核酸擴增過程不再需要類似PCR的多個溫度模塊，在1個溫度下即可完成擴增過程，極大的降低了反應(yīng)儀器構(gòu)造的復(fù)雜度，在操作便捷程度上具有比PCR明顯的優(yōu)勢［31］。針對LAMP產(chǎn)物的檢測，常用的檢測手段包括瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用熒光染料，或通過利用濁度計檢測，同樣具有與PCR產(chǎn)物檢測相似的弊端，如檢測儀器昂貴、假陽性率高、易接觸有毒試劑等［32，33］。LAMP-LFD技術(shù)利用熒光素標記的探針特異性地與LAMP產(chǎn)物結(jié)合，在很大程度上降低了結(jié)果的假陽性，同時LAMP產(chǎn)物通過LFD試紙條檢測，完全摒棄了對凝膠成像系統(tǒng)、濁度計、熒光定量PCR儀等設(shè)備的依賴，檢測更加適應(yīng)于基層的即時檢測［28］。在檢測耗時方面，Cao和Thongkao等［24，25］利用LAMP進行核酸擴增的時間分別是60 min和90 min，而本研究建立的LAMPLFD技術(shù)，核酸擴增僅需40 min，加上LFD判斷結(jié)果的時間也只需要50 min。

4 結(jié)論

本研究以哈維氏弧菌的溶血素基因為檢測靶標，建立了LAMP-LFD方法。該方法可特異性檢出哈維氏弧菌，針對創(chuàng)傷弧菌等其他弧菌，遲緩愛德華菌、單增李斯特菌、海豚鏈球菌及嗜水氣單胞菌等常見水產(chǎn)病原菌均無交叉反應(yīng)，自模板加入后，整個檢測過程僅需50 min即可完成，針對細菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度達到1.0×102CFU/mL或2 CFU/反應(yīng)，重復(fù)性良好，儀器需求簡單，可應(yīng)用于哈維氏弧菌的基層即時檢測。

［1］Pedersen K, Verdonck L, Austin B, et al. Taxonomic evidence that Vibrio carchariae Grimes et al. 1985 is a junior synonym of Vibrio harveyi（Johnson and Shunk 1936）Baumann et al. 1981［J］. Int J Syst Bacteriology, 1998, 48（3）：749-758.

［2］Vattanaviboon P, Mongkolsuk S. Unusual adaptive, cross protection responses and growth phase resistance against peroxide killing in a bacterial shrimp pathogen, Vibrio harveyi［J］. FEMS Microbiology Letters, 2001, 200（1）：111-116.

［3］Austin B, Zhang XH. Vibrio harveyi：a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates［J］. Letters in Applied Microbiology, 2006, 43（2）：119-124.

［4］Gr?slund S, Bengtsson BE. Chemicals and biological products used in south-east Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment—a review［J］. Science of the Total Environment, 2001, 280（1）：93-131.

［5］Liu PC, Lee KK, Yii KC, et al. Isolation of Vibrio harveyi from diseased kuruma prawns Penaeus japonicus［J］. Current Microbiology, 1996, 33（2）：129-132.

［6］Ruangpan L, Danayadol Y, Direkbusarakom S, et al. Lethal toxicity of Vibrio harveyi to cultivated Penaeus monodon induced by bacteriophage［J］. Diseases of Aquatic Organisms, 1999, 35：195-201.

［7］Harris L, Owens L, Smith S. A selective and differential medium for Vibrio harveyi［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62（9）：3548-3550.

［8］Nicolas JL, Basuyaux O, Mazurie J, et al. Vibrio carchariae, a pathogen of the abalone Haliotis tuberculata［J］. Diseases of Aquatic Organisms, 2002, 50（1）：35-43.

［9］Lightner DV, Redman RM, Pantoja CR, et al. Early mortality syndrome affects shrimp in Asia［J］. Glob Aquacult Advocate, 2012, 1（15）：40.

［10］Tran L, Nunan L, Redman RM, et al. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp［J］. Diseases of Aquatic Organisms, 2013, 105（45）：e55.

［11］Zhou J, Fang W, Yang X, et al. A nonluminescent and highly virulent Vibrio harveyi strain is associated with “bacterial white tail disease” of Litopenaeus vannamei shrimp［J］. PLoS One, 2012, 7（2）：e29961.

［12］Chen C, Cheng B, Yu H, et al. Isolation and identification of a pathogenic bacterium from Epinephelus septemfasciatus with exophthalmic disease［J］. Prog Polym Sci, 2010, 31：25-33.

［13］Zhang FP, Peng ZL, Zhang J, et al. Isolation and identification of the pathogenic strain of Vibrio harveyi from Miichthys miiuy［J］. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50：304-309.

［14］王江勇, 孫秀秀, 王瑞旋, 等. 雜色鮑肌肉萎縮癥病原菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 南方水產(chǎn)科學, 2010, 6（5）：21-26.

［15］Zhang XJ, Bai XS, Yan BL, et al. Vibrio harveyi as a causative agent of mass mortalities of megalopa in the seed production of swimming crab Portunus trituberculatus［J］. Aquaculture International, 2014, 22（2）：661-672.

［16］Thompson FL, Gevers D, Thompson CC, et al. Phylogeny and molecular identification of vibrios on the basis of multilocus sequence analysis［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71（9）：5107-5115.

［17］Cano-Gomez A, Bourne DG, Hall MR, et al. Molecular identification, typing and tracking of Vibrio harveyi in aquaculture systems：current methods and future prospects［J］. Aquaculture, 2009, 287（1）：1-10.

［18］Thompson CC, Vicente AC, Souza RC, et al. Genomic taxonomy of vibrios［J］. BMC Evolutionary Biology, 2009, 9：258.

［19］Gurtler V, Mayall BC. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001, 51：3-16.

［20］Schikorski D, Renault T, Paillard C, et al. Development of TaqMan real-time PCR assays for monitoring Vibrio harveyi infection and a plasmid harboured by virulent strains in European abalone Haliotis tuberculata aquaculture［J］. Aquaculture, 2013, 392：106-112.

［21］ Caipang CMA, Pakingking JrRV, Apines-Amar MJS, et al. Development of a polymerase chain reaction（PCR）assay targeted to the dnaJ gene of Vibrio harveyi, a bacterial pathogen in Asian seabass, Lates calcarifer［J］. AACL Bioflux, 2011, 4：447-454.

［22］Cano-Gomez A, H?j L, Owens L, et al. A multiplex PCR-based protocol for identification and quantification of Vibrio harveyirelated species［J］. Aquaculture, 2015, 437：195-200.

［23］Haldar S, Neogi SB, Kogure K, et al. Development of a haemolysin gene-based multiplex PCR for simultaneous detection of Vibrio campbellii, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus［J］. Letters in Applied Microbiology, 2010, 50（2）：146-152.

［24］Cao YT, Wu ZH, Jian JC, et al. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Vibrio harveyi in cultured marine shellfish［J］. Letters in Applied Microbiology, 2010, 51（1）：24-29.

［25］Thongkao K, Longyant S, Silprasit K, et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio harveyi by loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick targeted to vhhP2 gene［J］. Aquaculture Research, 2013, 46（5）：1122-1131.

［26］Ding WC, Chen J, Shi YH, et al. Rapid and sensitive detection of infectious spleen and kidney necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick［J］. Archives of Virology, 2010, 155（3）：385-389.

［27］Puthawibool T, Senapin S, Kiatpathomchai W, et al. Detection of shrimp infectious myonecrosis virus by reverse transcription loopmediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick［J］. J Virol Methods, 2009, 156（1）：27-31.

［28］王耀煥, 王瑞娜, 周前進, 等. 環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條快速檢測創(chuàng)傷弧菌檢測方法的建立［J］. 生物技術(shù)通報, 2014（6）：81-87.

［29］Pang L, Zhang XH, Zhong Y, et al. Identification of Vibrio harveyi using PCR amplification of the toxR gene［J］. Letters in Applied Microbiology, 2006, 43（3）：249-255.

［30］Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Development of H5-RTLAMP（loop-mediated isothermal amplification）system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection［J］. Vaccine, 2006, 24（44）：6679-6682.

［31］ Mori Y, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）：a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases［J］. J Infec Chemother, 2009, 15（2）：62-69.

［32］Borst A, Box ATA, Fluit AC. False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays：suggestions for a prevent and destroy strategy［J］. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2004, 23（4）：289-299.

［33］Wong ML, Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation［J］. Biotechniques, 2005, 39（1）：75-85.

（責任編輯 狄艷紅）

Visual Detection of Vibrio harveyi Based on Loop-mediated Isothermal Amplification Combined with a Lateral Flow Dipstick

CHENG Die CHAI Fang-chao CAI Yi ZHOU Qian-jin CHEN Jiong
（Department of Biology and Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

Based on nucleotide enrichment by a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）and chromatographic visualization by a lateral flow dipstick（LFD）assay，this work aims to develop a novel LAMP-LFD method for the rapid detection of Vibrio harveyi. Three pairs of primers were designed using the hemolysin gene（vhhA）of V. harveyi as detection target，and used in LAMP reaction，among which the forward inner primer vhhA-FIP was biotinylated. Similarly，a fluorescein isothiocyanate（FITC）-labeled probe vhhA-HP was designed to specifically hybridize with LAMP products. And then the hybridized LAMP products were visually detected by LFD. The optimized LAMP was performed at 63℃ for 40 min；and visual detection via LFD took 50 min. The results indicated that LAMP-LFD was able to specifically identify V. harveyi from other 9 pathogenic bacteria commonly existing in the aquatic animals，such as V. vulnificus. The detection limit of LAMP-LFD was 1.0×102CFU/mL for V. harveyi pure cultures（equivalent to 2 CFU per reaction），and 5×102CFU/mL for V. harveyi contaminated tissues of large yellow croaker（equivalent to 20 CFU per reaction），both of which were 100 times lower than that of the conventional PCR method using both outer primers vhhA-F3/vhhA-B3. Therefore，this rapid and accurate LAMP-LFD method is a promising alternative in the surveillance and point-of-care test of V. harveyi in sea farming.

Vibrio harveyi；hemolysin；loop-mediated isothermal amplification；lateral flow dipstick；assay detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.010

2015-08-31

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2012AA020101），國家星火計劃（2014GA701007），浙江省重大科技專項重點社會發(fā)展項目（2013C03045-1），寧波市科技創(chuàng)新團隊項目（2015C110018），寧波大學學科項目（XKL14D2083）

程蝶，女，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：17855822426@163.com

周前進，男，博士，講師，研究方向：動物疫病診斷技術(shù)；E-mail：mumu2325@163.com