擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子AtWRI1研究進(jìn)展

楊先友 黃有軍 張通 黃春穎

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州 311300）

擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子AtWRI1研究進(jìn)展

楊先友 黃有軍 張通 黃春穎

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州 311300）

油脂具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究植物油脂合成的調(diào)控過(guò)程具有重要意義。轉(zhuǎn)錄激活因子WRI1在油脂合成調(diào)控中起關(guān)鍵作用。綜述了AtWRI1的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式、功能和調(diào)控機(jī)制。AtWRI屬于AP2/EREPB家族中的AP2亞族，具有7個(gè)外顯子，在植物各器官的不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但在種子的油脂合成時(shí)期表達(dá)量最高。它與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，能夠轉(zhuǎn)錄激活糖酵解和脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)油脂的合成。AtWRI1是AtLEC1和AtLEC2的下游基因；在CRL3-BPM復(fù)合體介導(dǎo)下，AtWRI1通過(guò)泛素-26S蛋白酶體途徑降解。

油脂合成；AtWRI1；表達(dá)模式；轉(zhuǎn)錄激活；調(diào)控機(jī)制

油脂不僅是人類和動(dòng)物不可或缺的食物，也是重要的工業(yè)原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。油料種子積累的油脂主要以三酰甘油（triacylglycerols）的形式存儲(chǔ)于油體中，為種子萌發(fā)和形態(tài)建成提供碳源和能量［2］。三酰甘油是丙三醇和脂肪酸的酯化物，主要通過(guò)Kennedy途徑合成［3，4］。

模式植物擬南芥屬于十字花科植物，其種子含油量高，是研究脂代謝的理想載體。通過(guò)分析擬南芥基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在不同發(fā)育階段，質(zhì)體中的乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）4種亞基（BC、BCCP、α-CT和β-CT）的表達(dá)量幾乎不變［4］；參與同一個(gè)代謝過(guò)程的多數(shù)基因具有相似的表達(dá)譜［5］，表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控在油脂合成過(guò)程中具有重要作用，從而為高油作物遺傳育種工作指明了方向。WRINKLED1（WRI1）是目前唯一確定的特異性正向調(diào)控糖酵解和脂肪酸合成過(guò)程的轉(zhuǎn)錄激活因子，具有重要研究意義［6］。近年來(lái)已相繼在擬南芥、油菜、玉米等多種植物中找到了該基因，并對(duì)AtWRI1的生物學(xué)功能做了深入研究。丁霄等［7］報(bào)道了WRI1在主要作物中的研究現(xiàn)狀。綜述了擬南芥AtWRI1的研究進(jìn)展，主要從AtWRI1的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)模式、生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制加以闡述，為將來(lái)WRI1的深入研究提供參考。

1 AtWRI1的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)特征

一般而言，油脂密度小于蛋白質(zhì)和碳水化合物。因此，如果種子含油量降低，種子密度則會(huì)相應(yīng)增加?；谶@樣的假設(shè)，1998年，F(xiàn)ocks和Benning［8］對(duì)經(jīng)化學(xué)誘變處理獲得的M2群體通過(guò)種皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和密度的觀測(cè)，篩選到包括wri1-1在內(nèi)的若干等位擬南芥突變體 。wri1-1突變體種子胚中的質(zhì)體丙酮酸激酶（plastidial pyruvate kinase，PKp）的活性僅為野生型的28%，甚至比pkpβ1pkpα雙突變體更低［9］，這說(shuō)明了WRI1的重要性。與表面皺縮的豌豆相似［10］，由于種皮發(fā)育正常而脂類物質(zhì)含量減少，wri1突變體種子干燥后發(fā)生明顯皺縮，因此該基因被命名為WRINKLED1（WRI1）。wri1-1在種子淀粉含量，形態(tài)建成和光合能力方面與野生型擬南芥沒(méi)有差異，但種子（包括胚乳和胚）含油量大幅下降，油體結(jié)構(gòu)異常［11］，脂肪酸組分發(fā)生變化，可溶性糖含量增加，蛋白含量略有減少，種皮褶皺，胚發(fā)育延緩，下胚軸生長(zhǎng)不正常，發(fā)芽率和可育性降低。通過(guò)對(duì)該突變體進(jìn)行遺傳作圖、酶活測(cè)定和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AtWRI1是一個(gè)與油脂合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控糖酵解和脂肪酸合成效率。Cernac和Benning［12］通過(guò)圖位克隆和遺傳學(xué)方法確定了AtWRI1的基因座（At3G54320）。

AtWRI1具有兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞核，屬于AP2/EREPB家族中的AP2亞族，與胚珠及花發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AINTEGUMENTA（ANT）具有較高的相似性［13］。在NCBI的GENE數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示W(wǎng)RI1同源基因具有相似的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。包括AtWRI1在內(nèi)的多數(shù)WRI1基因具有7個(gè)外顯子，其中第三個(gè)外顯子僅含9個(gè)核苷酸，高度保守，對(duì)應(yīng)WRI蛋白第一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的3個(gè)氨基酸殘基（VYL）（圖1）。這3個(gè)氨基酸對(duì)AtWRI1的生物學(xué)功能具有重要作用［14］。AtWRI1具有At3G54320.1、At3G54320.2和At3G54320.3三種剪接體，但在擬南芥種子和其他組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中僅檢索到At3G54320.3。目前關(guān)于AtWRI1的研究均以At3G54320.3為研究對(duì)象，本文中的AtWRI1均指At3G54320.3。

圖1 AtWRI1基因和對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

2 AtWRI1表達(dá)模式與功能研究

基因表達(dá)模式與其功能密切相關(guān)，深入研究WRI1的表達(dá)模式有利于開(kāi)展其功能研究。AtWRI1在種子、莖、葉、根和花中都有表達(dá)，但在種子中表達(dá)量最高［12］。糖酵解過(guò)程為脂肪酸合成提供原料，該過(guò)程的關(guān)鍵基因PKp1和PKp2在胚中的表達(dá)模式與AtWRI相近，對(duì)應(yīng)的突變體表型與wri相似［15］，反映了AtWRI1在糖酵解調(diào)控過(guò)程中的重要作用。糖異生過(guò)程涉及到許多糖酵解相關(guān)酶，存在于各個(gè)器官與組織中，說(shuō)明AtWRI1在莖、根等器官中有少量表達(dá)。將AtWRI1的啟動(dòng)子區(qū)域（起始密碼子前的1 028 bp）和報(bào)告基因GUS構(gòu)建表達(dá)載體并在擬南芥中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AtWRI1在胚和胚乳發(fā)育的早期已有少量表達(dá)；到魚雷形胚時(shí)，在胚根和子葉外圍的表達(dá)較強(qiáng)；隨著胚的發(fā)育，逐漸向子葉內(nèi)部擴(kuò)展，但在種皮中始終未見(jiàn)表達(dá)。擬南芥油脂主要在胚和胚乳中積累，AtWRI1表達(dá)的組織特異性與之一致。在開(kāi)花后第8-10天，AtWRI1在角果中的表達(dá)達(dá)到峰值，恰好是種子開(kāi)始積累油脂的階段。之后其mRNA豐度緩慢降低；但到種子成熟階段其表達(dá)維持在較低水平還是快速增強(qiáng)還存有爭(zhēng)議［12，16］。

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料，目前TAIR已收集到5個(gè)wri等位突變體，其中wri1-1在第一個(gè)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基發(fā)生點(diǎn)突變（G>A）導(dǎo)致異常剪接，不能正常翻譯出該轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而不能正常積累油脂。2002年，Ruuska等［5］對(duì)不同發(fā)育時(shí)期wri1-1種子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥種子相比，其1%基因的表達(dá)受到顯著影響，絕大多數(shù)是在野生型擬南芥中具有單峰表達(dá)譜的碳水化合物代謝相關(guān)基因或脂肪酸從頭合成相關(guān)基因。轉(zhuǎn)錄激活因子與其靶基因具有相似的表達(dá)模式，并且在表達(dá)豐度上呈正相關(guān)［17］。利用基因芯片雜交、定量PCR和Western-blot等技術(shù)分析wri1突變體和AtWRI1超量表達(dá)株的基因表達(dá)明確了AtWRI1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。目前已確定其靶基因多是糖酵解相關(guān)基因和脂肪酸從頭合成相關(guān)基因，在野生型擬南芥中具有相似的表達(dá)譜。多數(shù)靶基因在突變體中仍有本底表達(dá)，與酶活測(cè)定的結(jié)果相一致［18］，而多數(shù)靶基因在AtWRI1超量表達(dá)株中表達(dá)量增加，雖然增加幅度遠(yuǎn)不如AtWRI1。wri突變體中的靶基因的本底表達(dá)表明AtWRI1是在種子發(fā)育的特定階段激活相關(guān)基因的表達(dá)，而另有其他功能因子維持這些基因的本底表達(dá)。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase1，DGAT1）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS2）和脂肪酸延長(zhǎng)酶（fatty acid elongase1，F(xiàn)AE1）在wri突變體中表達(dá)減弱，但AtWRI1的超量表達(dá)沒(méi)有使之表達(dá)增強(qiáng)，且它們的表達(dá)譜與其他靶基因不同，推測(cè)AtWRI1需要與其他功能因子協(xié)同作用才能轉(zhuǎn)錄激活這些基因［19］。在超量表達(dá)株中，AtWRI1和其靶基因表達(dá)水平不同幅度的提升也證明了這一觀點(diǎn)。AtWRI1和其靶基因之間在表達(dá)上存在一定的時(shí)間差。wri-1中脂肪酸修飾或Kennedy途徑相關(guān)基因的表達(dá)沒(méi)有受到明顯影響，AtWRI1超量表達(dá)株和wri突變體中脂肪酸組分的變化與之相一致。AtWRI通過(guò)調(diào)控糖酵解和脂肪酸合成過(guò)程促進(jìn)油脂合成，而不直接參與脂肪酸修飾和三酰甘油合成過(guò)程。由Nitrogen Regulatory Protein PII 1-like（GLB1）編碼的PП蛋白通過(guò)影響ACCase活性從而負(fù)向調(diào)控脂肪酸生物合成［20，21］。AtGLB1也被AtWRI1正向調(diào)控，體現(xiàn)了生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性與精密性。此后，To等［22］又獲得了AtWRI1的3個(gè)旁系同源基因，即AtWRI2、AtWRI3和AtWRI4。AtWRI2在不同組織都有表達(dá)，但不能轉(zhuǎn)錄激活A(yù)tWRI1的靶基因，這可能是由于它的第二個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域存在較大變異而導(dǎo)致的。AtWRI2沒(méi)有參與到油脂合成的調(diào)控過(guò)程中，可能具有其他的生物學(xué)功能，目前對(duì)該基因的研究較少。AtWRI3和AtWRI4主要在葉和花器官中表達(dá)，也能促進(jìn)脂肪酸合成，對(duì)應(yīng)突變體花瓣表面角質(zhì)中的雙羧基脂肪酸和ω-羥基脂肪酸含量減少，花瓣粘連在一起。AtWRI3和AtWRI4調(diào)控角質(zhì)中脂肪酸的合成，而AtWRI1調(diào)控儲(chǔ)存脂中脂肪酸的合成，三者在功能上既相互聯(lián)系又相互區(qū)別。需要說(shuō)明的是，對(duì)于不同基因型的擬南芥，WRI1促進(jìn)油脂合成的能力不同，這可能是由內(nèi)源基因表達(dá)模式?jīng)Q定的［23］。Ws型擬南芥中油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)水平不是限制油脂合成的因素；因此就促進(jìn)油脂合成的作用而言，在Ws中AtWRI1的超量表達(dá)作用不如在Col中明顯。

Maeo等［19］將報(bào)告基因GUS與AtWRI1靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建表達(dá)載體和AtWRI1共轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中確定了與AtWRI1結(jié)合的順式作用元件。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)AtWRI1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)具有保守性較強(qiáng)的序列，被稱為AW-box［CnTnG］（n）7［CG］（n為任意核苷酸）。許多AtWRI1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域具有2個(gè)AW-box，都是具有功能的順式作用元件。AW-box緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）或在5'UTR內(nèi)，與TSS的距離應(yīng)不超過(guò)400 bp，否則不能特異性表達(dá)。Tabach等［24］曾報(bào)道CArG-box及NF-KB-motif的轉(zhuǎn)錄激活效率及其與TSS之間的距離直接相關(guān)。2個(gè)AW-box之間的距離也能影響WRI1的轉(zhuǎn)錄激活的組織特異性［25］。兩個(gè)核心motif即［TnCnG］和［CG］被7個(gè)任意核苷酸隔離，核心motif上發(fā)生任意點(diǎn)突變都會(huì)減弱AtWRI1蛋白與它的結(jié)合程度。AtWRI1定位在細(xì)胞核，完整的結(jié)構(gòu)是其生物學(xué)活性的前提［26］。這兩個(gè)motif可能分別與AtWRI1蛋白的兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用。Baud等［23］確定了AtWRI1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的另一個(gè)順式作用元件， 即15-bp element（5'-cAAAAG（t/g）Agg（a/g）gttT-3'）。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在油棕中果皮表達(dá)的若干油脂合成相關(guān)基因也具有AW-box，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)15-bp element［27］。AtWRI1靶基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)還存在其他保守性較低的元件，或許也能與AtWRI1蛋白或其他因子相互作用?；虻谋磉_(dá)與調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，這兩個(gè)不同的順式作用元件可能在依賴AtWRI1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有不同的作用。另外，通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BnWRI1能夠與GT1-element和GCC-box發(fā)生作用，說(shuō)明不同物種之間依賴WRI1的調(diào)控機(jī)制也不盡相同。

3 AtWRI1調(diào)控機(jī)制

植物具有復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境和不同的發(fā)育狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因的表達(dá)，因此對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控至關(guān)重要［28］。AtWRI1在擬南芥中存在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)不同水平的調(diào)控機(jī)制。LEC2與胚發(fā)育相關(guān)，能夠激活A(yù)tWRI1的表達(dá)［29-31］，而lec2突變體中AtWRI1的表達(dá)下降，表達(dá)譜改變，在wri1-1突變體中超表達(dá)AtLEC2不能增加種子油脂含量。這些說(shuō)明AtLEC2是AtWRI1的上游基因，其功能的發(fā)揮需要AtWRI1的介導(dǎo)。AtLEC2的另一個(gè)下游基因AtLEAFY COTYLEDON1（LEC1）也正向調(diào)控AtWRI1的表達(dá)［32］。wri1-1突變體中mRNA豐度異常高，表達(dá)譜也發(fā)生變化，AtWRI1活性的干擾實(shí)驗(yàn)也得到類似的結(jié)果，推測(cè)擬南芥中存在著反饋調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控AtWRI1的表達(dá)。選擇性剪接是許多基因的調(diào)控方式［33］，AtWRI1也存在選擇性剪接。AtWRI1第三外顯子僅有9個(gè)核酸，屬于micro-exons［34］，對(duì)應(yīng)AtWRI蛋白第一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域內(nèi)“VYL”3個(gè)氨基酸殘基（圖1）。這3個(gè)氨基酸在WRI同源基因中高度保守，具有重要作用，且多數(shù)由第3個(gè)僅含9個(gè)核苷酸的外顯子翻譯而來(lái)。該外顯子的作用可能是調(diào)控AtWRI1的轉(zhuǎn)錄激活［35］。許多轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)復(fù)合體（同源或異源）的形式發(fā)揮作用，而在截短或修飾后則能干擾復(fù)合體的形成或其轉(zhuǎn)錄激活作用［36］。AtWRI1具有不同的剪接體，是否存在這種調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄因子的泛素化和之后通過(guò)26S蛋白酶體的降解對(duì)于其功能的實(shí)現(xiàn)具有重要作用。蛋白泛素化是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，植物體內(nèi)有近1 500種蛋白-泛素連接酶（E3），CULLIN-RING泛素連接酶（CRL）是其中主要的一種。BTB/POZ-MATH（BPM）在C端和N端分別具有BTB/POZ和MATH結(jié)構(gòu)域［37］，在ERF/AP2家族蛋白的泛素化過(guò)程中具有重要作用［38］。CRL3是CRL的一個(gè)亞族，能與BPM形成復(fù)合體以泛素化AtWRI1蛋白，被泛素化的AtWRI1蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。

4 展望

代謝過(guò)程中的一個(gè)酶促反應(yīng)對(duì)于整個(gè)過(guò)程的影響是有限的［39］，而WRI1可在種子發(fā)育的特定階段單獨(dú)起作用或與其他作用因子相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活參與糖酵解和脂肪酸合成過(guò)程中的重要基因，從而影響油脂合成過(guò)程。目前已一定程度地了解了AtWRI1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2），是基因改良工程可行的重要基因；若結(jié)合其他基因的操控能更為有效地提高植物種子或營(yíng)養(yǎng)器官的含油量，改變脂肪酸組分［40，41］，因此WRI1具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 AtWRI1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

AtWRI1在油脂合成過(guò)程中具有重要作用，理解AtWRI1的作用機(jī)制是利用該基因促進(jìn)油脂合成的基礎(chǔ)，在如下幾個(gè)方面仍需深入研究。（1）AtWRI1存在不同的剪接體，但目前對(duì)AtWRI1的選擇性剪接和不同剪接體的功能研究較少。（2）AtWRI1異常表達(dá)會(huì)引起發(fā)芽率降低，形態(tài)建成不正常，目前還無(wú)法確定是由AtWRI1的異常表達(dá)直接引起，還是由油脂含量異常、代謝狀態(tài)改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻等因素間接引起。（3）在AtWRI1超量表達(dá)株中，相對(duì)于AtWRI1表達(dá)量的增加，其靶基因的表達(dá)量并沒(méi)有大幅增加；酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtWRI1可以自激活，推測(cè)AtWRI1蛋白以二聚體或多聚體（同源或異源）形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能，其機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。（4）AtWRI啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件及其蛋白三維結(jié)構(gòu)特征的分析有利于揭示它的作用機(jī)制。（5）AtWRI1蛋白的減少會(huì)引起AtWRI1轉(zhuǎn)錄水平的提高，關(guān)于AtWRI1的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances on Transcriptional Activator AtWRI1 of Arabidopsis

YANG Xian-you HUANG You-jun ZHANG Tong HUANG Chun-ying
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Hangzhou 311300）

As lipid has high economic value，studying the regulation process in oil biosynthesis is of great significance. WRI1，a transcriptional activator，plays a key role in this process. This paper focuses on its identification and structural characteristics，expression pattern，function and the regulation mechanism of AtWRII. It belongs to AP2 subtribe of AP2/EREB family and has 7 exons. It expresses at different developmental stages of each organ，and the expressional level reaches the maximum at the oil synthesis stage of seeds. Through binding corresponding cis-function components，it activates the transcription of genes involving in glycolysis and fatty acid synthesis，and consequently promotes the oil synthesis. AtWRII is one of the downstream genes of AtLEC1 and AtLEC2. Mediated by CRL3-BPM complex，AtWRI1 is degraded via ubiquitin-26S proteasome pathway.

oil synthesis；AtWRI1；expression pattern；transcriptional activation；regulation mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.004

2015-09-06

楊先友，男，碩士研究生，研究方向：森林培育學(xué)經(jīng)濟(jì)林；E-mail：yangxianyou8@163.com

黃有軍，男，博士，副教授，研究方向：植物發(fā)育生物學(xué)；E-mail：youjunhuang@163.com