• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雞球蟲(chóng)DNA疫苗在生產(chǎn)推廣過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)

    2016-06-05 14:14:18楊錦昌周曉波
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2016年2期
    關(guān)鍵詞:球蟲(chóng)臟器月齡

    楊錦昌 周曉波

    (鹽城市畜牧獸醫(yī)站,江蘇鹽城 224002)

    雞球蟲(chóng)DNA疫苗在生產(chǎn)推廣過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)

    楊錦昌 周曉波

    (鹽城市畜牧獸醫(yī)站,江蘇鹽城 224002)

    雞球蟲(chóng)病是雞常見(jiàn)的一種急性流行性原蟲(chóng)病。以消瘦、貧血、血痢、生長(zhǎng)發(fā)育受阻為特征;病原為艾美耳屬的7種球蟲(chóng),其中危害最大的有兩種:柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和毒害艾美耳球蟲(chóng),前者寄生于盲腸中,后者寄生于小腸粘膜中,臨床上往往表現(xiàn)為多種球蟲(chóng)混合感染。本病以濕熱多雨的夏季多發(fā),主要發(fā)生于3個(gè)月以?xún)?nèi)的幼雞,其中以2~7周齡雞最易感,10日齡以?xún)?nèi)雛雞少發(fā),成年雞感染則不表現(xiàn)癥狀;1月齡左右雞多患盲腸球蟲(chóng),2月齡以上雞多患小腸球蟲(chóng)。一旦發(fā)病,重則引起大面積的死亡,輕則導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受陰,影響其正常生產(chǎn)性能。目前生產(chǎn)實(shí)踐中多采用在飼料中添加抗球蟲(chóng)藥物預(yù)防和治療,由于藥物的長(zhǎng)期使用,逐漸產(chǎn)生了抗藥性,導(dǎo)致防控效果越來(lái)越差。如何找到一種更好的預(yù)防辦法是當(dāng)務(wù)之急,使用疫苗防疫可以起到事半功倍的效果。

    雞球蟲(chóng)DNA疫苗;檢測(cè);質(zhì)粒DNA

    雞球蟲(chóng)DNA疫苗是免疫效果較好的基因疫苗之一。這些疫苗大部分在實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)可以提供對(duì)球蟲(chóng)卵囊的免疫保護(hù)力,但對(duì)其安全性的認(rèn)識(shí)只停留在理論分析階段,缺乏對(duì)雞球蟲(chóng)DNA疫苗的生物安全性評(píng)價(jià),致其還不能用于生產(chǎn)實(shí)際。為了充分評(píng)價(jià)DNA疫苗的生物安全性,我們選取四種有代表性的球蟲(chóng)疫苗,分別為pVAX1.0-TA4-IL-2,pVAX1.0-NA4-IL-2,pVAX1.0-EM8-IL-2,pVAX1.0-LDH-IL-2進(jìn)行試驗(yàn)。旨在為該疫苗應(yīng)用的可行性提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器的準(zhǔn)備

    質(zhì)粒,主要試劑及儀器的準(zhǔn)備,所需溶液及其配置。

    1.2 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化及制備

    用大腸桿菌DH5α制備感受態(tài)細(xì)胞,按分子常規(guī)克隆方法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化。裂解法制備大量質(zhì)粒,PEG沉淀法進(jìn)行純化。

    1.3 質(zhì)粒的定量定性及鑒定

    分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的含量,雙酶酶切質(zhì)粒,跑電泳進(jìn)行鑒定。

    1.4 試驗(yàn)動(dòng)物的分組和免疫

    選擇1日齡小公雛,將制備的四種DNA疫苗混合,通過(guò)腿部肌肉分別注射給不同組別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,同時(shí)每組設(shè)置PBS注射的空白對(duì)照。分組如下:

    組別 雞日齡(d) 數(shù)量(只) 接種方式 劑量(μg/只) 接種次數(shù)(次) 間隔天數(shù)(d) 疫苗批次1 1 120 肌肉注射 25 1 0 同一批2 120 肌肉注射 25 3 7 同一批3 14 240 肌肉注射 75 1 0 3個(gè)批次7

    1.5 引物的設(shè)計(jì)

    根據(jù)四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和序列,分別設(shè)置四對(duì)特異性引物。

    1.6 受試動(dòng)物臨床反應(yīng)的觀察

    每天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲水、進(jìn)食、糞便、活動(dòng)及死亡情況等,并進(jìn)行詳細(xì)的記錄。

    1.7 質(zhì)粒在組織中的分布和存留時(shí)間

    免疫后每2~4周隨機(jī)處死5只雞,分別采取血液、心、肝、脾、腎臟、注射部位肌肉,RT-PCR檢測(cè)。

    1.8 病理學(xué)變化檢測(cè)

    處死試驗(yàn)雞的同時(shí)多點(diǎn)采取心、肝、脾、腎、腸及腿部注射部位肌肉,按常規(guī)方法制備石蠟切片,蘇木精——伊紅(H.E)染色方法進(jìn)行染色并鏡檢分析。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫前后精神狀態(tài)良好;采食量、飲水沒(méi)有明顯變化;糞便情況良好;活動(dòng)情況正常;沒(méi)有發(fā)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物突然死亡的情況;說(shuō)明受試動(dòng)物對(duì)該疫苗無(wú)不良生理反應(yīng)。

    2.2 質(zhì)粒在注射部位及主要臟器的分布和存留

    (1)實(shí)驗(yàn)組1組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表:

    ?

    M:.MarkerDL2000,1.陽(yáng)性對(duì)照,2.陰性對(duì)照,3.心,4.肝,5.脾,6.腎,7.注射部位,8.血液A:免疫后1個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果 B:免疫后1.5個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果C:免疫后2個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果D:免疫后3個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果E:免疫后4個(gè)月EM8基因組擴(kuò)增結(jié)果

    (2)實(shí)驗(yàn)組2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表:

    及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合EM8 心、肝、脾、腎NA4 心、肝、脾、腎檢測(cè)基因 檢出部位 變化趨勢(shì) 最晚檢出時(shí)間 結(jié)論TA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合NA4 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合EM8 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合LDH 心、肝、脾、腎及注射部位 逐漸減少 2至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合及注射部位 逐漸減少 3至4月齡 質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合LDH 心、肝、脾、腎

    (3)實(shí)驗(yàn)組3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果:注射疫苗后,前兩個(gè)月三個(gè)批次的疫苗均在注射部位組織、心、肝、脾和腎中能擴(kuò)增出特異性DNA片段,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),疫苗DNA在體內(nèi)存在的量越來(lái)越少,到2至4月齡,在所有組織中幾乎檢測(cè)不到特異性DNA,說(shuō)明質(zhì)粒DNA也未與染色體DNA發(fā)生整合。

    2.3 臟器組織病理學(xué)變化

    (1)免疫后1個(gè)月,組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

    免疫后免1個(gè)疫后月1主個(gè)要月組主織要組圖織片圖(片4(0040×0×))A.心 B.肝A. 心C.B脾.肝 CD..脾腎D .腎E.E肌.肌肉肉 FF..十十二二腸腸

    2)免疫后1.5個(gè)月,組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

    免疫后1.5個(gè)月主要組織圖片(400×)A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

    (3)免疫后2個(gè)月,組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

    免疫后2個(gè)月主要組織圖片(400×)A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

    (4)免疫后3個(gè)月,組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

    免疫后3個(gè)月主要組織圖片(400×)A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

    (5)免疫后4個(gè)月,組織臟器均未見(jiàn)病理變化。

    免疫后4個(gè)月主要組織圖片(400×)A.心 B.肝 C.脾 D.腎 E.肌肉 F.十二指腸

    3 討論

    DNA疫苗是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗,由于它既具有亞單位苗和滅活苗的安全性,又兼?zhèn)渲挥卸久缁蛑亟M疫苗才具有的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。DNA疫苗很可能給免疫預(yù)防治療領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)根本性的變革。然而,在大范圍的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)之前,還有許多急需解決的問(wèn)題。而首先應(yīng)考慮的問(wèn)題就是DNA 疫苗的安全性問(wèn)題。主要是確定其是否被整合到宿主基因組 DNA中。本試驗(yàn)室選擇美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)可的安全性較高的pVAX1.0作為球蟲(chóng)DNA疫苗的表達(dá)載體。

    本試驗(yàn)通過(guò)PCR檢測(cè)了四種DNA疫苗在注射部位的存留以及在主要臟器的分布和存留。經(jīng),疫苗在免疫后的1~2個(gè)月在血液,心臟,肝臟,脾臟,腎臟和疫苗注射部位的肌肉都能檢測(cè)到。說(shuō)明免疫后質(zhì)??赡軙?huì)隨血液分布到各組織,并在組織中停留一段時(shí)間。隨著時(shí)間的推移,在免疫后的3個(gè)月之后就一直檢測(cè)不出質(zhì)粒的存在。說(shuō)明質(zhì)粒在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的代謝,可以被宿主清除。并且四種質(zhì)粒DNA的代謝速度較為一致,僅有個(gè)別組在免疫后的2個(gè)月就檢測(cè)不到質(zhì)粒,分析原因應(yīng)為由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活環(huán)境差異導(dǎo)致的,并不影響本實(shí)驗(yàn)對(duì)四種疫苗的安全性評(píng)價(jià)。

    基因疫苗致使組織產(chǎn)生病理學(xué)損害的可能原因有三,一是因質(zhì)粒純度不夠,宿主菌殘留成分導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)或毒性反應(yīng);二是質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物可能具有某種程度的毒性或刺激機(jī)體產(chǎn)生超敏反應(yīng);三是質(zhì)粒序列可能與受試動(dòng)物基因組發(fā)生整合,整合后可能導(dǎo)致原癌基因的表達(dá)或抑癌基因失活,使被整合細(xì)胞發(fā)生惡性變。本試驗(yàn)所應(yīng)用的質(zhì)粒DNA本身沒(méi)有任何毒副作用,也不刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,在組織中以附加體的形式存在,并隨著細(xì)胞的代謝逐漸消失,不應(yīng)引起炎性反應(yīng),并且質(zhì)粒DNA為純化制品,細(xì)菌蛋白成分已經(jīng)被最大限度的抽提去除,DNA樣品在紫外分光定量時(shí),純度在95%以上,蛋白質(zhì)達(dá)到“檢不出”的水平,可以認(rèn)為不存在宿主菌蛋白成分,同時(shí)溶解質(zhì)粒的介質(zhì)是0.01M pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液,該介質(zhì)自身無(wú)任何毒副作用,也不會(huì)“誘導(dǎo)”質(zhì)粒DNA產(chǎn)生任何毒副作用。因此,雖然質(zhì)粒DNA分布到了心臟,肝臟,脾臟,腎臟和肌肉,但無(wú)可見(jiàn)的組織病理學(xué)變化。質(zhì)粒DNA與受試動(dòng)物染色體整合的可能性及激活原癌基因或滅活抑癌基因的可能性均很小或無(wú)。因此,從理論上來(lái)看,不可能導(dǎo)致機(jī)體臟器產(chǎn)生組織病理學(xué)變化。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步印證了這一點(diǎn)。

    本試驗(yàn)在進(jìn)行生物安全性評(píng)定的同時(shí),還對(duì)該疫苗的免疫程序進(jìn)行了初步探索。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重復(fù)接種后質(zhì)粒在機(jī)體組織中的存留與一次接種后質(zhì)粒在組織中的存留無(wú)太大差別,有關(guān)基因免疫是否需要加強(qiáng)免疫說(shuō)法不一。有報(bào)道認(rèn)為,DNA疫苗免疫大動(dòng)物一次后即可誘發(fā)較好的體液免疫,且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng);但也有報(bào)道認(rèn)為,須經(jīng)加強(qiáng)免疫后方可達(dá)到較高水平。本試驗(yàn)重復(fù)接種組與其他組并沒(méi)有太大差別,引起這種結(jié)果的原因可能有多種:第一,DNA免疫后肌細(xì)胞和如何受納質(zhì)粒DNA,受納率和受納量是多少還不是很清楚,不同的雞只間可能有差異;第二,不同的受試動(dòng)物所受納的含有完整表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA的量不同,從而導(dǎo)致表達(dá)的蛋白量不同,表達(dá)量低,相對(duì)來(lái)說(shuō)免疫反應(yīng)就比較弱;第三,不同機(jī)體對(duì)所表達(dá)外源蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)弱不同。因此在保證安全性的前提下,要探索一種免疫程序延長(zhǎng)質(zhì)粒在組織中的存留時(shí)間,使得延長(zhǎng)在體內(nèi)的免疫保護(hù)效果。

    本試驗(yàn)也對(duì)超劑量接種的情況作了研究,研究表明質(zhì)粒在三個(gè)月的時(shí)候已經(jīng)檢測(cè)不到,在組織中也沒(méi)檢測(cè)到病理變化,因此,超劑量接種對(duì)雞體是安全的。

    目前國(guó)外有關(guān)DNA疫苗安全性報(bào)道的研究不多,就從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,實(shí)驗(yàn)中的四種球蟲(chóng)DNA疫苗對(duì)雞體都是相對(duì)安全的。

    [1]黃金貴,李運(yùn)娜,張西臣.雞球蟲(chóng)病疫苗的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2011,(8):983-987.

    [2]張擇揚(yáng). 四種雞球蟲(chóng)DNA疫苗在機(jī)體組織中的分布和在環(huán)境中的釋放[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

    猜你喜歡
    球蟲(chóng)臟器月齡
    肉雞球蟲(chóng)疾病藥物防治效果的分析
    一例由大網(wǎng)膜破裂致多臟器粘連導(dǎo)致牛死亡的病例淺析
    湖州33月齡男童不慎9樓墜落上海九院對(duì)接“空中120”成功救治
    提高育肥豬出欄率合理的飼養(yǎng)密度
    不同月齡荷斯坦牛產(chǎn)奶量的研究
    在達(dá)古雪山巔
    紅巖(2017年6期)2017-11-28 19:16:31
    3種消毒藥對(duì)豬球蟲(chóng)的體外抑殺效果觀察
    不同月齡嬰兒ABR正常值分析
    毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)間在免疫方面的相互影響
    手術(shù)治療盆腔臟器脫垂137例臨床分析
    少妇熟女欧美另类| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产最新在线播放| 成年av动漫网址| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品女同一区二区软件| 久久精品久久久久久久性| 欧美潮喷喷水| 久久久久久九九精品二区国产| av免费在线看不卡| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产成人午夜福利电影在线观看| 1000部很黄的大片| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩亚洲欧美综合| 日本一本二区三区精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产 一区精品| 国产一区二区三区av在线| 直男gayav资源| 国产91av在线免费观看| 91精品国产九色| 美女主播在线视频| 国产综合懂色| 亚洲美女搞黄在线观看| 成年免费大片在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲最大成人中文| 一区二区三区高清视频在线| 久久99蜜桃精品久久| 深夜a级毛片| 又大又黄又爽视频免费| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩欧美三级三区| 国产成人精品婷婷| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品三级大全| 舔av片在线| 久久精品综合一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品一区二区性色av| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美一区二区三区国产| 老司机影院成人| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 深爱激情五月婷婷| 卡戴珊不雅视频在线播放| 97在线视频观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| av在线天堂中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 亚洲内射少妇av| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品一及| 欧美精品国产亚洲| 亚洲18禁久久av| 高清av免费在线| 综合色av麻豆| 精品久久久精品久久久| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产成人一精品久久久| 内地一区二区视频在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 全区人妻精品视频| 国产一区二区在线观看日韩| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产精品成人综合色| av网站免费在线观看视频 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久久久久久大av| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩中字成人| 久久久国产一区二区| 中国国产av一级| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 免费看不卡的av| 久久精品国产亚洲av涩爱| av天堂中文字幕网| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩精品有码人妻一区| 国产综合精华液| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产成人精品一,二区| 黄色日韩在线| av播播在线观看一区| 久久精品综合一区二区三区| 综合色丁香网| 欧美另类一区| 两个人视频免费观看高清| 国产老妇伦熟女老妇高清| 超碰97精品在线观看| 免费看日本二区| 欧美 日韩 精品 国产| 简卡轻食公司| 五月天丁香电影| 久久99热6这里只有精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲久久久久久中文字幕| 直男gayav资源| 国产淫语在线视频| 国产乱人偷精品视频| av黄色大香蕉| 亚洲无线观看免费| 国内精品一区二区在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品aⅴ在线观看| 男人舔奶头视频| 精品人妻视频免费看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 色综合站精品国产| 免费在线观看成人毛片| 国产日韩欧美在线精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 嫩草影院入口| 日韩欧美国产在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品国产成人久久av| 麻豆乱淫一区二区| 少妇高潮的动态图| 欧美精品国产亚洲| 婷婷色av中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜免费激情av| 国产高清三级在线| 两个人的视频大全免费| 欧美一区二区亚洲| 99久久人妻综合| 欧美区成人在线视频| av免费在线看不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 中文资源天堂在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产精品成人久久小说| 99久久九九国产精品国产免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产免费视频播放在线视频 | 久久久国产一区二区| 久99久视频精品免费| 可以在线观看毛片的网站| 男女边摸边吃奶| 91久久精品国产一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 97超视频在线观看视频| 久久99热6这里只有精品| 国产毛片a区久久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 午夜免费激情av| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩中字成人| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲自拍偷在线| 国产高清有码在线观看视频| 免费少妇av软件| 亚洲精品aⅴ在线观看| or卡值多少钱| 中文在线观看免费www的网站| 午夜福利高清视频| 一级毛片久久久久久久久女| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美区成人在线视频| 国产黄a三级三级三级人| a级毛色黄片| 国产黄片美女视频| 色综合站精品国产| 高清毛片免费看| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区四区激情视频| 日韩一区二区视频免费看| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 春色校园在线视频观看| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在线 av 中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久精品夜色国产| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产欧美人成| 99热6这里只有精品| 亚洲最大成人中文| 久久99蜜桃精品久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一级av片app| 亚洲,欧美,日韩| 边亲边吃奶的免费视频| 日日啪夜夜撸| 久久人人爽人人爽人人片va| 好男人视频免费观看在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 少妇的逼水好多| 少妇高潮的动态图| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品国产成人久久av| 六月丁香七月| 欧美3d第一页| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产探花极品一区二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 中文字幕制服av| 国产精品综合久久久久久久免费| 六月丁香七月| 国产精品99久久久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 身体一侧抽搐| 一区二区三区免费毛片| 国产成人freesex在线| 亚洲18禁久久av| 国产一级毛片在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产成人a∨麻豆精品| 免费观看精品视频网站| 国产不卡一卡二| 能在线免费观看的黄片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产在视频线在精品| 日韩人妻高清精品专区| 丰满少妇做爰视频| av在线亚洲专区| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久精品国产亚洲网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本三级黄在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品,欧美精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲欧美成人精品一区二区| xxx大片免费视频| 亚洲av不卡在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 大片免费播放器 马上看| 赤兔流量卡办理| 久久久久久伊人网av| 国产亚洲一区二区精品| 我的老师免费观看完整版| 久久精品久久精品一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩一区二区三区影片| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 成年av动漫网址| 国产精品国产三级专区第一集| 最后的刺客免费高清国语| 日韩国内少妇激情av| 一级a做视频免费观看| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 18+在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久久久久黄片| 久久久久精品性色| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久久久午夜电影| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 美女高潮的动态| 免费人成在线观看视频色| 精品熟女少妇av免费看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲国产最新在线播放| 天堂影院成人在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲最大成人中文| 国产 一区精品| 欧美zozozo另类| 国产在线一区二区三区精| 国产av码专区亚洲av| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品久久久久久久末码| 亚洲美女搞黄在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品久久久精品久久久| 岛国毛片在线播放| 天美传媒精品一区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色哟哟·www| 日本一本二区三区精品| 美女黄网站色视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99热全是精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜免费激情av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲最大成人av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 女人被狂操c到高潮| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲av免费高清在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av一区综合| av专区在线播放| 国产精品一及| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女主播在线视频| 一边亲一边摸免费视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费看a级黄色片| 亚洲国产最新在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品第二区| 亚洲精品一二三| 五月伊人婷婷丁香| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜福利成人在线免费观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品一及| 亚洲欧美清纯卡通| 免费少妇av软件| 欧美精品一区二区大全| 国产视频首页在线观看| 婷婷色av中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久久伊人网av| 老司机影院成人| 欧美人与善性xxx| 亚洲国产精品sss在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 日韩一本色道免费dvd| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 在现免费观看毛片| 两个人的视频大全免费| 乱系列少妇在线播放| 日韩欧美 国产精品| 一本一本综合久久| 永久免费av网站大全| 成年人午夜在线观看视频 | 亚洲av成人av| 久久99热6这里只有精品| 免费观看av网站的网址| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 如何舔出高潮| 少妇丰满av| 亚洲av不卡在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 啦啦啦啦在线视频资源| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美bdsm另类| 色尼玛亚洲综合影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产在线一区二区三区精| 亚洲美女视频黄频| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| videos熟女内射| 99久久精品热视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品色激情综合| 国产探花在线观看一区二区| 欧美另类一区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| av在线天堂中文字幕| av在线亚洲专区| 国产综合精华液| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产黄片视频在线免费观看| 国产黄片美女视频| 国内精品宾馆在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 不卡视频在线观看欧美| 久久97久久精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av国产久精品久网站免费入址| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 最后的刺客免费高清国语| 天堂中文最新版在线下载 | 成人二区视频| 日韩精品有码人妻一区| 又爽又黄a免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人综合一区亚洲| 色综合站精品国产| 亚洲性久久影院| 一级毛片电影观看| 人妻一区二区av| 成人午夜高清在线视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久6这里有精品| 国产精品.久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女cb高潮喷水在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产乱人视频| 国产69精品久久久久777片| 五月伊人婷婷丁香| 欧美成人午夜免费资源| xxx大片免费视频| 久久这里有精品视频免费| av在线天堂中文字幕| 久久久a久久爽久久v久久| 日本黄大片高清| 一区二区三区免费毛片| 99久久九九国产精品国产免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产大屁股一区二区在线视频| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜激情福利司机影院| 日韩国内少妇激情av| 精品午夜福利在线看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一区二区三区四区激情视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 色视频www国产| 久久久午夜欧美精品| 最近手机中文字幕大全| 色5月婷婷丁香| 亚洲av成人av| 丝瓜视频免费看黄片| 久久热精品热| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲最大成人中文| 久久久久久久午夜电影| 晚上一个人看的免费电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 欧美丝袜亚洲另类| 插逼视频在线观看| 一夜夜www| 久久久欧美国产精品| 亚洲av免费在线观看| 99热这里只有精品一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 九草在线视频观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 中文字幕av成人在线电影| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 777米奇影视久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 97热精品久久久久久| 免费观看av网站的网址| 久久人人爽人人片av| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品久久久久久成人av| 我的女老师完整版在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲最大成人av| 少妇高潮的动态图| 久久久久精品性色| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日日啪夜夜爽| 欧美另类一区| 亚洲经典国产精华液单| 简卡轻食公司| 亚洲国产精品sss在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲性久久影院| 国产成人a∨麻豆精品| 精品熟女少妇av免费看| 在线免费观看不下载黄p国产| 深夜a级毛片| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产在视频线精品| 在线观看av片永久免费下载| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 青春草视频在线免费观看| 亚洲18禁久久av| 精品久久久噜噜| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费在线观看成人毛片| 久久国产乱子免费精品| 亚洲四区av| 日韩人妻高清精品专区| 97精品久久久久久久久久精品| 男女边摸边吃奶| 国产精品国产三级国产专区5o| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 天堂俺去俺来也www色官网 | 亚洲内射少妇av| 国产午夜精品一二区理论片| 国产男人的电影天堂91| 男女那种视频在线观看| 国产av不卡久久| 亚洲精品一二三| 日韩成人av中文字幕在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 嫩草影院精品99| 中文资源天堂在线| 观看美女的网站| 久久久久久久久久久免费av| 国产免费视频播放在线视频 | 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 夫妻午夜视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 97在线视频观看| 看黄色毛片网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 三级国产精品片| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 五月天丁香电影| 欧美变态另类bdsm刘玥| 乱人视频在线观看| 特级一级黄色大片| 六月丁香七月| 成人毛片60女人毛片免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产伦在线观看视频一区| 69av精品久久久久久| 插逼视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 国产精品一区www在线观看| freevideosex欧美| 免费看日本二区| 中文欧美无线码| 如何舔出高潮| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品国产亚洲av天美| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美xxxx性猛交bbbb| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 又爽又黄无遮挡网站| 久久99蜜桃精品久久| 国产乱来视频区| 欧美日韩在线观看h| 在线 av 中文字幕| 亚洲av二区三区四区| av卡一久久| 在线天堂最新版资源| 国产成人a∨麻豆精品| 不卡视频在线观看欧美| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | freevideosex欧美| 国产一级毛片在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产高清国产精品国产三级 | 久久久色成人| 免费看a级黄色片| 内地一区二区视频在线| 亚洲av免费在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 在线免费十八禁| 亚洲av.av天堂| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 看十八女毛片水多多多| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 美女黄网站色视频| 看免费成人av毛片|