金銀花和山銀花抗急性口腔炎癥作用比較*

李泮霖，賀利利，李楚源，白 楊，王德勤，廖弈秋，李沛波，吳 忠，蘇薇薇

(1. 中山大學生命科學學院，廣東 廣州510275；2. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州510515)

金銀花和山銀花抗急性口腔炎癥作用比較*

李泮霖1，賀利利1，李楚源2，白 楊1，王德勤2，廖弈秋1，李沛波1，吳 忠1，蘇薇薇1

(1. 中山大學生命科學學院，廣東 廣州510275；2. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州510515)

采用香煙煙霧提取物刺激KB細胞，構建急性口腔炎癥模型；用Elisa法測定炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的表達量；以考察金銀花、山銀花抗炎活性的差異。結果顯示，與空白組相比，模型組促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高，抗炎因子IL-10水平顯著降低，屬急性炎癥表現(xiàn)，說明造模成功。金銀花提取物或山銀花提取物處理后，均可抑制TNF-α、IL-6、IL-8表達水平的升高，改善IL-10分泌減少，且呈劑量依賴關系，提示金銀花和山銀花對口腔炎癥均具有一定的治療作用。對二者的藥效結果比較，山銀花對各炎癥因子的調(diào)控作用均強于金銀花，尤其對TNF-α、IL-6和IL-10的調(diào)控作用具有顯著差異。本研究從藥效角度對金銀花和山銀花進行比較研究，為合理利用金銀花和山銀花藥材提供了依據(jù)。

金銀花；山銀花；KB細胞；急性口腔炎癥

從《中華人民共和國藥典》2005版開始，金銀花和山銀花分列為兩種藥材[1]。二者原植物種屬相近、藥材外觀形態(tài)相似，市場上金銀花和山銀花藥材品種混亂、來源不清、質量良莠不齊的現(xiàn)象極為突出，直接影響到藥材及其制劑的療效。已有研究采用外觀形態(tài)鑒別、化學成分分析、DNA分子鑒定等方法，對金銀花和山銀花的不同品種進行區(qū)分和鑒定[2-5]，這些方法雖然可以明確藥材的種屬來源，但無法直接體現(xiàn)藥效的優(yōu)劣。

金銀花和山銀花屬清熱解毒類中藥材，臨床廣泛應用于抗炎、抗病毒[6]；金銀花、山銀花及其制劑應用于口腔疾病的預防和治療，具有良好的療效[7]。本研究選用急性口腔炎癥模型，考察相關炎癥因子的表達差異，從藥效角度對金銀花、山銀花進行評價和區(qū)分，為臨床合理使用金銀花和山銀花藥材提供了依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品與試劑

金銀花藥材(產(chǎn)地：山東)、山銀花藥材(產(chǎn)地：湖南)，由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，經(jīng)廖文波教授鑒定，分別為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.和灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.。

椰樹牌香煙[廣東中煙工業(yè)有限公司，含有w(一氧化碳) 13 mg，w(焦油) 11 g，w(煙堿) 1 mg]；KB細胞(廣州弗爾博生物科技有限公司)；TNF-α、IL-8、IL-6、IL-10 Elisa試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司，貨號：SEA133Hu，SEA080Hu，SEA079Hu，SEA056Hu)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國 GIBCO，貨號：C11875500BT)；胎牛血清(美國 GIBCO，貨號：1420768)；MTT(美國Sigma Aldrich，貨號：M2128)；地塞米松(中國藥品生物制品檢定所，批號：100129-201105)；二甲基亞砜(上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20140909)；磷酸鹽緩沖溶液(美國Hyclone，貨號：SH30256.01B)。

1.2 實驗儀器

細胞培養(yǎng)瓶(德國Corning公司，貨號：430639)；6孔細胞培養(yǎng)板(廣州JET BIOFIL，貨號：TCP001006)；96孔細胞培養(yǎng)板(廣州JET BIOFIL，貨號：TCP001096)； 0.22 μm 無菌過濾器(美國密理博，貨號：SLGP033RB)。

2 實驗方法

2.1 金銀花浸膏、山銀花浸膏制備

分別取各藥材1.5 kg，加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.26～1.29(80 ℃)，加入乙醇使含醇量達50%，充分攪拌，靜置12 h以上，取上清液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮成稠膏；制得金銀花浸膏405 g、山銀花浸膏435 g，得膏率分別為27%和29%。

2.2 細胞培養(yǎng)

將KB細胞培養(yǎng)于含φ=10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(pH 7.2，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)中，在37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。用吸管吸棄舊培養(yǎng)基，更換吸管，于非細胞培養(yǎng)面加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕輕搖晃使其覆蓋整個瓶底，吸棄PBS，更換吸管，重復洗滌一次；加入少量細胞消化液，37 ℃鏡下觀察消化；當細胞明顯回縮后，加入少量新鮮細胞培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打底面2～3次后收集所有液體入新離心管中；1 200 r/min離心8 min，棄上清，細胞沉淀用適量新鮮培養(yǎng)基懸??；加入到新培養(yǎng)瓶中，標記瓶號與細胞批次。MTT測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，并鋪96孔板，每孔200 μL； Elisa測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為4×105個/mL，并鋪24孔板，每孔0.5 mL。細胞培養(yǎng)24 h后，待密度至80%給藥。

2.3 香煙煙霧提取物的制備及藥物的配制

2.3.1 香煙煙霧提取物制備 制備香煙煙霧提取物裝置時，將1.5 mL離心管接上香煙，將其底部剪開，然后套上橡膠軟管，同時橡膠軟管的另一端連接上50 mL注射器。將10 mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基轉移至50 mL注射器中，并將注射器中剩余空氣完全排出后待用。將香煙點燃，將裝置連接設置好，并確保裝置不漏氣即可開始實驗：先連接一只空的50 mL注射器，反復抽取3次，觀察抽取的香煙煙霧，確保香煙已充分燃燒，然后連接裝有10 mL無血清RPMI-1640的50 mL注射器，抽取50 mL充分燃燒的香煙煙霧到注射器中，充分震蕩，確保煙霧與培養(yǎng)基充分混勻，反復抽取6次，共計300 mL香煙煙霧，待煙霧完全溶于培養(yǎng)基后用0.22 μm濾膜過濾后除菌即可得到100%香煙煙霧提取物母液(100% CSE)。為驗證CSE母液的穩(wěn)定性，設置6組平行重復，檢測320 nm下的吸光度值A，得到RSD 值為1.68%，說明該方法所制備的CSE母液質量穩(wěn)定可靠，可用于下一步實驗。

將100%的CSE溶液用RPMI-1640培養(yǎng)基(無血清)稀釋到需要的體積分數(shù)后加入細胞，使CSE終體積分數(shù)為1%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%，30 min內(nèi)用于實驗。

2.3.2 藥物的配制 藥物用RPMI-1640培養(yǎng)基(無血清)配制，DEX配成終濃度1 μmol/L的溶液;金銀花浸膏配成終質量濃度為0.153 2，1.532，15.32，153.19，306.38，612.77 μg/mL生藥量的溶液；山銀花浸膏配成終質量濃度為0.164 5，1.645，16.45，164.54，329.08，658.16 μg/mL生藥量的溶液；經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后使用。

2.4 考察不同含量的藥物及CSE的細胞毒性

取生長狀態(tài)良好的KB細胞，用含φ=10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL，在37 ℃、φ=5% CO2條件下培養(yǎng)1～2 d；實驗前，將培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)基移除，換成新鮮的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基處理過夜。將100%香煙煙霧提取物用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成一系列梯度的CSE溶液(φ, 1%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%)；金銀花浸膏及山銀花浸膏配制成一系列梯度溶液(1、10、100、1 000 μg/mL)后加入96孔板的細胞中，37 ℃、φ=5% CO2條件下孵育24 h；每孔加入MTT溶液(5 mg/mL，用pH=7.4的PBS配制)20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清后每孔加入200 μL DMSO，然后將96孔板置于搖床上輕微搖動5 min使紫色結晶充分溶解，用超微量紫外/可見光分光光度計于490 nm波長下檢測96孔板的A值?？疾鞚舛忍荻鹊腃SE對KB細胞的毒性，根據(jù)公式：存活率=(給藥組A值/空白組A值)×100%，可計算出相應的存活率。

2.5 細胞急性炎癥實驗

2.5.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理 根據(jù)細胞毒性檢測結果，在對細胞無毒性作用的安全濃度范圍內(nèi)設置CSE和藥物的濃度。實驗共設置空白對照組、模型組(5%CSE)、陽性對照組(1 μmol/L地塞米松)、金銀花浸膏不同劑量組(0.153 2，1.532，15.32，153.19，306.38，612.77 μg/mL)、山銀花浸膏不同劑量組(0.164 5，1.645，16.45，164.54，329.08，658.16 μg/mL)。

將KB細胞培養(yǎng)于含φ=10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(pH 7.2，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)中，在37℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中孵育；用含φ=10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種到24孔板；培養(yǎng)24 h，待細胞長至80%密度時，以含各藥物的無FBS培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，空白對照組和模型組給予等量的無血清培養(yǎng)基，預處理30 min后用φ=5%CSE刺激KB細胞造模，空白對照組給予等量的無血清培養(yǎng)基。

2.5.2 樣品中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量檢測 細胞給藥24 h后收集細胞上清，4 ℃下1 500 r/min離心5 min后，棄去底部沉淀留上清，按試劑盒說明采用Elisa法測定IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量，實驗具體方法為：首先，設標準曲線蛋白孔，每孔依次加入不同質量濃度的標準蛋白溶液(1 000、500、250、125、62.5、31.2、15.6 pg/mL，以及標準蛋白稀釋液)100 μL；其次，加樣孔中每孔加入100 μL樣品蛋白，每個樣品設置6個重復孔，加樣后標記，酶標板覆膜，37 ℃下孵育2 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗滌；每孔加100 μL提前配好的檢測工作液A，孵育1 h；棄去孔內(nèi)液體，用自動洗板機重復洗板3次，洗完后把孔內(nèi)的洗滌液盡量甩干；每孔加100 μL提前配好的檢測工作液B，溫育30 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次；酶標板內(nèi)每孔加入底物反應溶液90 μL，37 ℃避光待其標準蛋白溶液顯色(反應時間在15～25 min之間)，當標準蛋白孔的前4個孔顏色出現(xiàn)明顯梯度，后4個孔也出現(xiàn)明顯藍色時，即可終止；每孔小心加入反應終止液50 μL，避免產(chǎn)生氣泡影響光密度測量，此時藍色的溶液轉變?yōu)辄S色；立即用多孔酶標儀測量450 nm下的的光密度(A值)。

2.6 數(shù)據(jù)分析方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析實驗結果，采用方差分析法對不同給藥組間差異進行統(tǒng)計分析，各組實驗結果均以平均數(shù)±標準差(mean±S.D.)表示，P<0.05說明兩者間有顯著性差異，P<0.01 說明兩者間有極顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 CSE及各樣品對KB細胞存活率的影響

研究結果顯示，φ=1% CSE刺激KB細胞24 h后與空白組沒有顯著區(qū)別，存活率為0.98；φ=10% CSE條件下，KB細胞的存活率下降至0.79，與空白組有極顯著差異；更高φ(CSE)刺激下細胞存活率持續(xù)降低(圖1)，因此選擇φ(CSE)為5%。各樣品的系列梯度溶液對KB細胞的存活率并無明顯影響(圖2、3)。說明金銀花、山銀花樣品對KB細胞均無毒性。

圖1 CSE對KB細胞存活率的影響(n=6，mean±S.D.)Fig.1 KB cell viability in different concentrations of CSE(n=6, mean±S.D.) 與空白對照組比較，**P<0.01

圖2 金銀花對KB細胞存活率的影響(n=6，mean±S.D.)Fig.2 KB cell viability in different concentrations of LJF與空白對照組比較，P>0.05

圖3 山銀花對KB細胞存活率的影響(n=6，mean±S.D.)Fig.3 KB cell viability in different concentrations of LF與空白對照組比較，P>0.05

3.2 金銀花、山銀花對CSE誘導急性口腔炎癥的作用

TNF-α、IL-8、IL-6和IL-10是參與炎癥反應的重要介質，可促進炎性反應進程，在許多炎性反應性疾病、免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。許多資料表明，口腔炎癥疾病，包括復發(fā)性口腔潰瘍(ROU)、口腔黏膜炎(OM)、口腔扁平苔癬(OLP)等的發(fā)病過程中涉及多種細胞因子分泌紊亂，如促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6的增加及抗炎因子IL-10的減少[8-9]。

3.2.1 促炎因子TNF-α水平 結果顯示，在φ=5% CSE刺激24 h后，KB細胞促炎因子TNF-α蛋白表達量顯著增加(圖4)，模型組蛋白表達量是空白組的5倍，說明造模成功。金銀花、山銀花對TNF-α的分泌都具有抑制作用，且呈劑量依賴關系。整體看來，山銀花對TNF-α升高的抑制作用強于金銀花，在濃度3、4、5、6組中二者的抑制作用具有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。

圖4 KB細胞炎性因子TNF-α蛋白表達量(n=6，mean±S.D.)**P<0.01；兩組之間比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01Fig.4 Protein expression level of TNF-α in KB cells (n=6, mean±S.D.)

3.2.2 抗炎因子IL-10水平φ=5% CSE刺激24 h后，KB細胞抗炎因子IL-10分泌量顯著降低。而金銀花、山銀花對CSE刺激引起的IL-10分泌減少都具有改善作用，且呈劑量依賴關系(圖5)。山銀花對IL-10分泌的促進作用均強于金銀花，在濃度6組中二者的作用具有顯著性差異(P<0.05)。

圖5 KB細胞炎性因子IL-10蛋白表達量(n=6，mean±S.D.)Fig.5 Protein expression level of IL-10 in KB cells (n=6, mean±S.D.)

3.2.3 促炎因子IL-6水平φ=5% CSE刺激24 h后，KB細胞促炎因子IL-6分泌量顯著升高。而金銀花、山銀花對CSE誘導的IL-6分泌都具有抑制作用，且呈劑量依賴關系(圖6)。并且山銀花的抑制作用均強于金銀花，在濃度6組中二者的作用具有極顯著差異(P<0.01)。

圖6 KB細胞炎性因子IL-6蛋白表達量(n=6，mean±S.D.)Fig.6 Protein expression level of IL-6 in KB cells (n=6, mean±S.D.)

3.2.4 促炎因子IL-8水平φ=5% CSE刺激24 h后，KB細胞促炎因子IL-8蛋白水平顯著升高。而金銀花、山銀花都能抑制CSE誘導的IL-8表達水平上升(圖7)。濃度5、濃度6組對IL-8升高有顯著抑制作用(P<0.05)。

圖7 KB細胞炎性因子IL-8蛋白表達量(n=6，mean±S.D.)Fig.7 Protein expression level of IL-8 in KB cells (n=6，mean±S.D)

4 討 論

本實驗用φ=5% CSE刺激KB細胞24 h后，可觀察到細胞內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8分泌顯著上升，抗炎因子IL-10分泌下降；這些指標均為炎癥反應免疫應答過程中的重要細胞因子，表明KB細胞急性口腔炎癥模型具有一定的臨床代表性。

本研究利用此模型對金銀花、山銀花的抗炎作用進行了考察和比較，結果表明兩種樣品對TNF-α、IL-8、IL-6的升高和IL-10的降低均可起到明顯改善作用，且呈劑量依賴關系。提示金銀花、山銀花對口腔炎癥疾病具有一定療效。同時品種間的比較結果顯示，金銀花和山銀花對TNF-α、IL-6和IL-10的調(diào)控作用均具有顯著差異，但山銀花的作用強于金銀花。

金銀花作為抗菌、抗病毒的常用藥材，市場需求緊張。據(jù)2011年統(tǒng)計全國金銀花需求在2 萬t左右，而金銀花的實際產(chǎn)量僅7 000 t，缺口巨大[10]。山銀花產(chǎn)量大、價格低，但其資源尚未得到充分利用。本研究從抗炎藥效方面對金銀花、山銀花進行考察，為合理利用金銀花和山銀花藥材提供了科學依據(jù)。

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Comparison of anti-inflammatory effects between Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos using an acute stomatitis model

LIPanlin1,HELili1,LIChuyuan2,BAIYang1,WANGDeqin2,LIAOYiqiu1,LIPeibo1,WUZhong1,SUWeiwei1

(1. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China；2. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Limited Company,Guangzhou 510515, China)

The acute stomatitis model in KB cells induced by cigarette smoke extract (CSE) has been established to study the anti-inflammatory effects between Lonicerae Japonicae Flos (LJF) and Lonicerae Flos (LF)，and the protein expression levels of TNF-α, IL-6, IL-8 and IL-10 were detected by Elisa method after treatments of LJF or LF extracts. The results showed that the extracts of LJF or LF could both reduce the protein expression levels of TNF-α, IL-6, IL-8, improve the low expression of IL-10 in a dose dependent manner, suggesting their certain anti-inflammatory effects.LF presented significant better anti-inflammatory effects than LJF in the regulation of TNF-α, IL-6 and IL-10. These results provided a basis for the rational utilization of LJF and LF herbs.

Lonicerae Japonicae Flos; Lonicerae Flos; KB cells; acute stomatitis model

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.04.019

2015-10-30

國家科技支撐計劃資助項目(2012BAI29B00)；廣州開發(fā)區(qū)科技領軍人才資助項目(2015P-158)

李泮霖(1989年生)，女；研究方向：中藥學；通訊作者：蘇薇薇;E-mail:lsssww@126.com

R969

A

0529-6579(2016)04-0118-05