FOXC1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

喬　麗　劉　杰　高　薇　林文俐　孫玉萍

(濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東　濰坊　261053)

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FOXC1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

喬麗劉杰1高薇2林文俐1孫玉萍1

(濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東濰坊261053)

〔摘要〕目的探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中FOXC1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)MaxVisionTM一步法檢測86例NSCLC組織及20例肺良性病變組織中FOXC1蛋白的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果FOXC1蛋白表達(dá)定位于NSCLC癌細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核內(nèi)；其在NSCLC組織及肺良性病變組織中的高表達(dá)率分別為62.79%(54/86)和25%(5/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，F(xiàn)OXC1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組中的高表達(dá)率為81.25%(39/48)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)率為39.47%(15/38)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；Ⅲ期NSCLC組中高表達(dá)率為77.8%(28/38)，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組中高表達(dá)率(52%，26/50)(P=0.015)；而與分化程度、組織學(xué)類型、腫瘤大小、性別、年齡、吸煙等均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。結(jié)論FOXC1蛋白可能在肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，可能為抑制NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)和方向。

〔關(guān)鍵詞〕FOXC1；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺惡性腫瘤的80%～85%〔1〕。盡管手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療在肺癌的治療中取得了長足的進(jìn)步，但肺癌患者的5年生存率僅為15%，導(dǎo)致上述現(xiàn)象的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。FOXC1蛋白是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子基因家族(FOX家族)的一員，可調(diào)節(jié)一系列的生物學(xué)過程。對FOXC1的早期研究主要集中在其對胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)其參與了眼睛、腎臟及肢體等重要器官的發(fā)育。近幾年研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。Du等〔2〕報道FOXC1能抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移和侵襲能力，然而，另有研究〔3～5〕結(jié)果提示高表達(dá)的FOXC1不僅可獨(dú)立誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，還可通過下調(diào)E-鈣黏附蛋白的表達(dá)促進(jìn)EMT的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。目前，F(xiàn)OXC1蛋白在NSCLC中的表達(dá)及臨床意義的研究國內(nèi)尚無報道。本研究旨在應(yīng)用免疫組化的方法，檢測FOXC1蛋白在NSCLC中的表達(dá)情況并探討其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，分析其在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本組織來源收集2008～2011年山東大學(xué)附屬醫(yī)院濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科86例NSCLC患者石蠟包埋組織，臨床資料記錄詳細(xì)?；颊呔鶠槌踉\，在我院行手術(shù)治療，術(shù)前均未進(jìn)行放化療及其他治療，術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)均為NSCLC。同時選取20例肺良性病變組織作為對照，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均未見癌細(xì)胞。86例NSCLC患者中，男63例，女23例；年齡35～81歲，中位年齡61歲；其中腺癌48例，鱗癌38例；TNM分期按UICC2010年修訂標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ期36例，依據(jù)病理分化程度類型分為:高-中分化癌41例，低分化癌45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的38例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并遵循患者知情同意的原則。

1．2主要試劑FOXC1羊抗人多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司(工作濃度1∶200)，MaxVisionTM超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1．3檢測方法采用免疫組織化學(xué)MaxVisionTM一步法進(jìn)行石蠟?zāi)[瘤組織中抗原檢測。所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)3～4 μm切片。切片烤片后常規(guī)脫蠟水化。FOXC1抗原在EDTA中高壓修復(fù)2 min，流水冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min；采用0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，每張切片滴加一抗50 μl，4℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；除去PBS液，每張切片滴加1滴即用型MaxVisionTM試劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次試驗(yàn)用已知陽性正常肺組織作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1．4結(jié)果判斷由具有正高職稱病理科醫(yī)師雙盲閱片，每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，陽性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度分值綜合評定。陽性細(xì)胞比率判定：0%為0分，1%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分；染色強(qiáng)度：未著色為0，淺黃色為1分，黃色2分，棕黃色為3分；兩者分?jǐn)?shù)相乘≤3為低表達(dá)，>3為高表達(dá)。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1FOXC1蛋白在NSCLC、肺良性病變組織中的表達(dá)FOXC1蛋白表達(dá)定位在胞核和胞質(zhì)，呈淺黃色、黃色或棕黃色顆粒(圖1)。FOXC1在肺腺癌、鱗癌中的胞質(zhì)及胞核中高表達(dá)，F(xiàn)OXC1在肺腺癌、鱗癌中胞質(zhì)中的高表達(dá)，F(xiàn)OXC1在肺腺癌、鱗癌中的陰性表達(dá)FOXC1沒有單獨(dú)核表達(dá)現(xiàn)象，多數(shù)以單獨(dú)胞質(zhì)表達(dá)形式存在，也存在核、質(zhì)同時表達(dá)。FOXC1在86例NSCLC中單獨(dú)質(zhì)高表達(dá)的例數(shù)為41例(47.67%)。NSCLS組與肺良性疾病變組間FOXC1蛋白高表達(dá)率分別為62.79%和25.0%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。見圖1。

圖1　FOXC1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)(DAB，×200)

2.2NSCLC中FOXC1蛋白的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系FOXC1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組中的高表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)率(P=0.000)；Ⅲ期中高表達(dá)率，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組中高表達(dá)率(P=0.015)。而FOXC1蛋白在NSCLC中的高表達(dá)率與其分化程度、組織學(xué)類型、腫瘤大小、性別、年齡及有無吸煙史等病理學(xué)特征無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，見表1。

表1　FOXC1在NSCLC組織中的表達(dá)及與

與相對臨床病理特征比較：1)P=0.000；2)P=0.015

3討論

轉(zhuǎn)錄因子FOXC1是叉頭框(FOX)轉(zhuǎn)錄基因家族(FOX家族)中的一員，與家族其他成員一樣，它具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，由100個氨基酸殘基組成的保守DNA結(jié)合區(qū)域，呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，位于染色體6p25，全長3 500 bp，僅包含一個長約1 600 bp的外顯子，編碼的蛋白質(zhì)含553個氨基酸殘基。FOXC1蛋白從N端到C端的結(jié)構(gòu)依次為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AD1)，DNA結(jié)合叉頭區(qū)(FHD)，抑制區(qū)/磷酸化區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AD2)，叉頭區(qū)的兩端均有1個核定位信號(NLS)〔6〕。FOXC1在組織的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，小鼠體內(nèi)FOXC1基因敲除后會導(dǎo)致心臟及血管流出道、腎臟、骨骼等多種組織和器官發(fā)育障礙〔7～9〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。FOXC1在胰腺癌中存在高表達(dá)，并且與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)〔10〕；另外，F(xiàn)OXC1在喉癌、肝細(xì)胞肝癌中都存在表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，與疾病進(jìn)展有關(guān)〔11，12〕，由此推測，F(xiàn)OXC1可能參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。然而，F(xiàn)OXC1在NSCLC中的作用研究甚少。

本研究顯示，F(xiàn)OXC1在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于肺良性病變組織，定位在胞核和胞質(zhì)，胞質(zhì)單獨(dú)表達(dá)的現(xiàn)象較高，所占比例為47.67%(41/86)。有研究證實(shí)FOXC1是一種核定位的磷酸蛋白，其通過叉頭區(qū)兩端的核定位信號(NLS)這一DNA結(jié)構(gòu)域結(jié)合目的基因片段，定位于胞核內(nèi)并參與轉(zhuǎn)錄過程〔6〕。但Taube等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)FOXC1有質(zhì)表達(dá)現(xiàn)象，且質(zhì)表達(dá)與核表達(dá)同時出現(xiàn)，這與本研究結(jié)果一致。與FOXC1同一家族的另一成員FOXO1，未磷酸化時定位在胞核，當(dāng)受到上游因子AKt作用后發(fā)生磷酸化，從胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)內(nèi)。因此FOXC1在胞質(zhì)中高表達(dá)可能與其磷酸化有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

已有研究證實(shí)，F(xiàn)OXC1在胰腺癌、喉癌、肝細(xì)胞肝癌中也存在表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，與疾病進(jìn)展有關(guān)〔10～12〕。推測FOXC1可能促進(jìn)了NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲過程。

FOXC1促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明確，但近年研究報道，EMT可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1通過促進(jìn)EMT的發(fā)生從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲及遷移〔13〕。癌細(xì)胞在EMT的過程中因喪失極性而獲得活動能力，可在細(xì)胞基質(zhì)間游走，形成局部擴(kuò)散，進(jìn)而侵入淋巴管及血管，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。Seo等〔14〕在胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子通過上調(diào)Dll4、Notch1、Notch4、Hey2及VEGF-C等的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管和淋巴管的形成。推測FOXC1通過促進(jìn)EMT的發(fā)生及淋巴管的形成，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，F(xiàn)OXC1蛋白在NSCLC的胞核或胞質(zhì)中存在高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。因此，明確FOXC1在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，可以為抑制NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)和方向。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項(xiàng)目：濟(jì)南青年科技明星計(jì)劃資助課題(No.20110321)

通訊作者：劉杰(1981-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤內(nèi)科及腫瘤血管生成研究。

〔中圖分類號〕R734.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2171-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.056

1山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院腫瘤科

2山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科

第一作者：喬麗(1984-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫研究。