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    MT01對人成骨樣細(xì)胞系MG63內(nèi)Toll樣受體7,9表達(dá)的影響

    2016-06-04 08:10:20申玉芹婁譯心孫新華
    中國老年學(xué)雜志 2016年9期

    孫 晗 侯 旭 申玉芹 鄭 義 婁譯心 汪 洋 齊 佳 孫新華

    (吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130021)

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    MT01對人成骨樣細(xì)胞系MG63內(nèi)Toll樣受體7,9表達(dá)的影響

    孫晗侯旭申玉芹鄭義婁譯心汪洋齊佳孫新華

    (吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,吉林長春130021)

    〔摘要〕目的探討人成骨樣細(xì)胞系MG63(簡稱MG63)內(nèi)Toll樣受體(TLRs)的表達(dá)情況及MT01與細(xì)胞內(nèi)TLRs的關(guān)聯(lián)。方法應(yīng)用RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLR1~10 mRNA的表達(dá)情況;MT01與MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法檢測MG63細(xì)胞內(nèi)TLR7,9 mRNA表達(dá)的變化;Western印跡法檢測MG63細(xì)胞內(nèi)TLR7,9 蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果MG63細(xì)胞表達(dá)TLR1~10 mRNA;一定濃度的MT01作用于細(xì)胞后,對TLR7,9 mRNA及蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用,這種抑制作用無時(shí)間依賴性。結(jié)論MG63細(xì)胞表達(dá)TLR1-10 mRNA,一定濃度的MT01可影響MG63細(xì)胞內(nèi)TLR7,9 mRNA及蛋白的表達(dá)。

    〔關(guān)鍵詞〕MT01;人成骨樣細(xì)胞系MG63;Toll樣受體

    Toll樣受體(TLRs)是一種模式識別受體,在高等脊椎動(dòng)物的固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著樞紐作用〔1〕。有研究表明,TLRs家族中諸如TLR9對牙槽骨改建具有調(diào)控作用,可調(diào)控骨改建過程中成骨細(xì)胞的成骨分化〔2〕。目前發(fā)現(xiàn),在TLRs受體家族中,存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體上的TLR7,9可識別引發(fā)早期固有免疫應(yīng)答的核酸類分子如寡脫氧核糖核苷酸(ODN)等〔3~5〕。MT01是本課題組依據(jù)人線粒體DNA序列設(shè)計(jì)并人工合成的單鏈DNA,是一種免疫負(fù)性調(diào)節(jié)劑,可抑制免疫細(xì)胞如人外周血單核細(xì)胞內(nèi)TLR7,9與激動(dòng)劑結(jié)合產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)〔5〕。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MT01可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、活化,抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收,促進(jìn)骨形成〔6,7〕。本實(shí)驗(yàn)擬研究一定濃度MT01對成骨細(xì)胞MG63內(nèi)TLR7,9表達(dá)的影響,為進(jìn)一步闡述MT01調(diào)控骨改建的免疫學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑超凈工作臺(tái)(TECH,中國);恒溫離心機(jī)(beckman coulter,美國); CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO,日本);倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本);100 mm培養(yǎng)皿、 6孔板、8聯(lián)管(COSTAR,美國);人源性成骨樣細(xì)胞系 MG63 (ATCC,CRL-1427),MT01(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室自主設(shè)計(jì)、大連TAKARA全硫代修飾合成);HG-DMEM(Gibco,美國);胎牛血清(PAA 公司,美國);胰蛋白酶(Sigma 公司,美國); TLR7,9一抗(博奧森,中國);β-actin一抗(Abcam,美國);過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(Molecular Probes,美國);RIPA裂解液 (鼎國昌盛,中國); TLR7,9 mRNA引物合成(三博遠(yuǎn)志,中國);SYBR Premix Ex Taq(大連TAKARA,中國);Primer Script RT reagent Kit(大連TAKARA,中國);反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR引物序列:TLR1:正義:CAGTGTCTGGTACACGCATGGT,反義:TTTCAAAAACCGTGTCTGTTAAGAGA;TLR2:正義:GCCAAAGTCTTGATTGATTGG,反義:TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG;TLR3:正義:CCTGGTTTGTTAATTGGATTAACGA,反義:TGAGGTGGAGTGTTGCAAAGG;TLR4:正義:GGTGGAAGTTGAACGAATGG,反義:CTGTCCTCCCACTCCAGGTA;TLR5:正義:CAGAAACCTGCCCAACCTTAG,反義:GATCCAAGCGAGTTAAAGCCTT;TLR6:正義:GTGAGTGGTGCCATTACGAA,反義:TTTGGGAAAGCAGAGTGGAG;TLR7:正義:TTACCTGGATGGAAACCAGCTAC,反義:TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCTAG;TLR8:正義:AGCGGATCTGTAAGAGCTCCATC,反義:CCGTGAATCATTTTCAGTCAAGAC;TLR9:正義:GCAGTCAATGGCTCCCAGTTC,反義:GCGGTAGCTCCGTGAATGAGTG;TLR10:正義:TTATGACAGCAGAGGGTGATGC,反義:CTGGAGTTGAAAAAGGAGGTTATAGG;GAPDH:正義:CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC,反義:TGAGCGATGTGGCTCGGCT。實(shí)時(shí)熒光定量(Real time)PCR引物序列:TLR7:正義:GGAGGTATTCCCACGAACACC,正義:TGACCCCAGTGGAATAGGTACAC;TLR9:正義:GGACCTCTGGTACTGCTTCCA,正義:AAGCTCGTTGTACACCCAGTCT;GAPDH:反義CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC,反義:TGAGCGATGTGGCTCGGCT。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLRs mRNA的表達(dá)情況 復(fù)蘇 MG63,含10%胎牛血清的HG-DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代,3×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度鋪6孔板,孵育24 h,收集細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制25 μl RT PCR反應(yīng)體系:Buffer(10×)2.5 μl,10 mmol/L dNTPs 2 μl,cDNA 1 μl,PCR上游引物0.5 μl,PCR下游引物0.5 μl,TaqDNA 聚合酶1 μl (2U),dd H2O 17.5 μl。PCR 條件為 94℃,60 s;55℃,120 s;72℃,90 s;循環(huán)30次。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,在GIS 1D 凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描定量。

    1.2.2Real time PCR法檢測MT01作用后不同時(shí)間點(diǎn)MG63內(nèi)TLR7,9 mRNA的表達(dá)情況細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板同前,加入含有1 mg/L MT01的完全培養(yǎng)基后,于共孵育12、24、48 h分別收集細(xì)胞,加入同體積磷酸鹽緩沖液(PBS)設(shè)為空白對照組。RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄同前。在8連管中配制25 μl Real time PCR 反應(yīng)體系:SYBR Primer Ex TaqTM(2×)12.5 μl,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ROX reference DyeⅡ(50×) 0.5 μl,cDNA 2 μl,ddH2O 9 μl。反應(yīng)條件:95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min,循環(huán)48次。

    1.2.3Western印跡法檢測MT01作用后不同時(shí)間點(diǎn)MG63內(nèi)TLR7,9 蛋白的表達(dá)情況細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板同前,加入含有1 mg/L MT01的完全培養(yǎng)基后,于共孵育12、24、48 h分別收集細(xì)胞,加入同體積PBS設(shè)為空白對照組。按照試劑盒說明提取蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行定量。之后分別將預(yù)染蛋白和樣品液上樣,電泳分離總蛋白。按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移說明書組裝濾紙凝膠纖維素夾層,60 V恒壓條件下,4℃轉(zhuǎn)移2 h。將轉(zhuǎn)移后的膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h,以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的膜加入一抗,4℃孵育過夜。加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗,室溫孵育2 h?;瘜W(xué)發(fā)光法檢測,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng)X膠片曝光顯影。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

    2結(jié)果

    2.1MG63內(nèi)TLRs mRNA表達(dá)情況成骨樣細(xì)胞MG63內(nèi)有TLR1~10 mRNA的表達(dá),其中TLR2,5,10 mRNA表達(dá)稍弱 (圖1)。

    圖1 RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLR1~10 mRNA的表達(dá)情況

    2.2不同時(shí)間點(diǎn)MT01對TLR7,9 蛋白表達(dá)的影響12、24 h組,TLR7蛋白量與對照組相比顯著減少,而48 h組的TLR7蛋白量與12、24 h組相比稍有增高,但仍低于對照組。實(shí)驗(yàn)組TLR9蛋白的表達(dá)量低于對照組(圖2)。

    圖2 MT01作用于MG63后,不同時(shí)間點(diǎn)TLR7, TLR9蛋白的表達(dá)情況

    2.3不同時(shí)間點(diǎn)MT01對TLR7,9 mRNA表達(dá)的影響Real time PCR檢測顯示:MT01能抑制細(xì)胞內(nèi)TLR7,9 mRNA的表達(dá)。12、24 h組中的TLR7 mRNA的表達(dá)量(0.072、0.071)顯著減少,與對照組(設(shè)為1)比差異顯著(P<0.05);48 h組中的TLR7 mRNA的表達(dá)量(0.124)與前兩組相比略微增高,但仍低于對照組(P<0.05)。12、24、48 h組中的TLR9 mRNA表達(dá)量(0.443、0.146、0.149)均低于對照組(設(shè)為1)(P<0.05)。但MT01對TLR7,9 mRNA的抑制作用沒有明顯的時(shí)間依賴性。

    3討論

    人成骨樣細(xì)胞系MG63具有與人成骨細(xì)胞相似的表型特征及分化特性〔8〕,因其具有易培養(yǎng)、價(jià)格便宜、取材方便等特性,近年來被廣泛用來研究成骨等方面的特性。關(guān)于不同來源的成骨細(xì)胞上TLRs的表達(dá)情況目前尚無定論。Yasuyuki等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞系SaOS-2表達(dá)TLR1,4,5,6,9 mRNA;有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上表達(dá)TLR1~10 mRNA〔10〕;而Takeshi等〔11〕對于MC3T3的研究發(fā)現(xiàn)老鼠的成骨細(xì)胞僅表達(dá)TLR2,4,3,6 mRNA。造成這種差異的原因可能由于細(xì)胞起源及細(xì)胞種類不同,所能表達(dá)的TLRs種類也各不相同〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TLRs的表達(dá)可能受細(xì)胞種類的影響。這也提示如果選用不同種屬的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),還要注意種屬特異性的問題。

    MT01(5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3')的序列富含胞嘧啶,Yang等〔5〕研究表明MT01可以識別免疫細(xì)胞內(nèi)的TLRs,并且抑制由TLR7,9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),這種免疫負(fù)調(diào)節(jié)活性可能是序列依賴性的。通過Hou等〔13〕對MT01進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)相性觀察發(fā)現(xiàn),隨著加藥時(shí)間的變化, MT01 進(jìn)入細(xì)胞的量表現(xiàn)出一定的時(shí)間依從性規(guī)律,在12 h進(jìn)入細(xì)胞的量達(dá)到了峰值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明MT01能抑制TLR7蛋白的表達(dá)。同時(shí)間點(diǎn)檢測的蛋白量與基因量稍有差異可能是由于在轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程中,影響翻譯的條件如原料、模板、能量和酶等發(fā)生變化引起的〔14〕。

    有研究表明TLR7,9的激活可導(dǎo)致自身免疫性疾病〔15〕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔16〕及各種自身免疫性疾病的發(fā)生。同時(shí)有研究表明表達(dá)于成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞上TLR9的激活,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生各種炎性因子如白介素、腫瘤壞死因子等〔2〕。這些炎性因子協(xié)同作用可以抑制成骨細(xì)胞的成骨功能,促進(jìn)破骨細(xì)胞活化,從而破壞骨改建的平衡,導(dǎo)致骨吸收〔17〕。本實(shí)驗(yàn)所用的這種新型的寡核苷酸MT01可以抑制TLR7,9的表達(dá),抑制早期祖細(xì)胞的TLRs活化,抑制骨含量減少,保持骨代謝與免疫系統(tǒng)的平衡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MT01作為一種免疫負(fù)性調(diào)節(jié)劑能夠影響成骨細(xì)胞TLR7,9的表達(dá),進(jìn)而可以影響骨改建進(jìn)程,因此,MT01有可能成為潛在的骨吸收抑制劑。深入研究MT01與骨改建的關(guān)系,可為今后的臨床應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    4參考文獻(xiàn)

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    〔2016-03-16修回〕

    (編輯曲莉)

    基金項(xiàng)目:吉林省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助項(xiàng)目(20150101173JC);吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃(2012080632)

    通訊作者:孫新華(1954-),女,教授,主要從事牙齒移動(dòng)生物學(xué)研究。

    〔中圖分類號〕R783.5

    〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

    〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2071-03;

    doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.010

    第一作者:孫晗(1990-),女,在讀碩士,主要從事牙齒移動(dòng)生物學(xué)研究。

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