雄激素調(diào)控RhoA/Rho激酶改善去勢大鼠勃起功能障礙的機制研究*

崔　凱，　李　瑞，　王　濤，　葉章群，　劉繼紅△，　饒　可△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院　1泌尿外科　2泌尿外科研究所，武漢　430030

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雄激素調(diào)控RhoA/Rho激酶改善去勢大鼠勃起功能障礙的機制研究*

崔凱1，2，李瑞1，2，王濤1，2，葉章群1，2，劉繼紅1，2△，饒可1，2△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院1泌尿外科2泌尿外科研究所，武漢430030

摘要：目的探究雄激素調(diào)控RhoA/Rho激酶改善去勢大鼠勃起功能障礙的機制。方法40只健康8周齡SD雄性大鼠隨機分成4組：A組為對照組；B組為實驗組，給予手術切除雙側(cè)睪丸；C、D組為干預組，大鼠手術去勢后每天給予不同濃度的十一酸睪酮(安特爾)灌胃(C組：20 mg/kg，D組：10 mg/kg)，其余組給予等量的生理鹽水。治療8周后，檢測大鼠血清睪酮濃度，海綿體測壓評價大鼠勃起功能，Western blot檢測大鼠陰莖海綿體S1P2/RhoA/Rho激酶的含量。結(jié)果相較于A組[(17.08±1.53)nmol/L]、C組[(15.47±1.62)nmol/L]和D組[(8.73±2.12)nmol/L]大鼠的血清睪酮濃度，B組[(1.34±0.62)nmol/L]明顯降低(均P<0.05)；海綿體測壓結(jié)果顯示B組MaxICP/MAP明顯小于A組、C組和D組(均P<0.05)；Western blot檢測S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白在B組表達明顯高于A組、C組和D組(均P<0.05)。結(jié)論應用安特爾進行雄激素替代治療可以通過抑制S1P2/RhoA/Rho激酶的激活，從而抑制陰莖海綿體平滑肌收縮，改善去勢大鼠勃起功能。

關鍵詞：RhoA/Rho激酶；雄激素；去勢；勃起功能障礙

陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指陰莖不能達到和(或)維持足夠的勃起硬度以獲得滿意的性生活[1]。來自馬薩諸塞州的一份報告顯示：全球年齡在40～70歲之間的男子中，ED的患病率高達52%[2]。如今，ED正在成為困擾全球男性的重要疾病之一。ED的發(fā)病因素有很多種，包括神經(jīng)因素、血管因素、內(nèi)分泌因素以及同樣重要的心理因素，其中由于老齡等因素引起的血清睪酮水平下降是導致ED的重要危險因素之一[3]。近年來受到廣泛關注的遲發(fā)型性腺功能減退癥(late-onset hypogonadism，LOH)就是一種與年齡增長相關的并且以血清睪酮低于正常水平為特征的臨床和生物化學綜合征，而由于血清睪酮水平降低而導致的ED則是LOH最主要的癥狀[4-5]。正常的血清睪酮水平是維持陰莖正常勃起的關鍵因素[6]。

陰莖勃起受到一氧化氮-環(huán)鳥苷酸(nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate，NO-cGMP)，RhoA/Rho激酶，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)等多種信號通路共同調(diào)節(jié)。已有的研究認為血清睪酮水平下降能夠通過NO-cGMP通路減少內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性和引起陰莖血管內(nèi)皮細胞功能障礙導致ED[7],而對于睪酮和RhoA/Rho激酶途徑之間的聯(lián)系研究較少。最近研究發(fā)現(xiàn)，主要由血小板和紅細胞產(chǎn)生的一種1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的鞘氨醇代謝產(chǎn)物可以通過作用于陰莖海綿體平滑肌上的S1P2受體，進而激活RhoA/Rho激酶途徑，引起陰莖海綿體平滑肌收縮[8]。本實驗對大鼠手術去勢之后給予不同濃度十一酸睪酮胺丸(安特爾)灌胃[9]，然后通過評價大鼠的勃起功能和檢測陰莖組織蛋白表達的結(jié)果，研究補充睪酮改善去勢大鼠勃起功能和S1P2以及RhoA/Rho激酶之間的聯(lián)系。

1材料與方法

1.1實驗材料

40只健康8周齡SD雄性大鼠(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供)；十一酸睪酮膠丸(安特爾，默沙東公司提供)；睪酮測定試劑盒(直接化學發(fā)光法，Siemens Healthcare Diagnostics Inc，美國)；RIPA裂解液(江蘇碧云天生物公司)；S1P2抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；RhoA抗體(英國Abcam公司)；ROCK1抗體(英國Abcam公司)；ROCK2抗體(美國Santa Cruz公司)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(武漢科瑞生物科技有限公司)；Powerlab四通道生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司)。

1.2模型的建立

40只健康8周齡SD雄性大鼠，體重250～310 g，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分成4組：A組為對照組；B組為實驗組，給予手術切除雙側(cè)睪丸；C、D組為干預組，在大鼠手術去勢后每天給予不同濃度的安特爾灌胃(C組：20 mg/kg，D組：10 mg/kg)，其余組給予等量的生理鹽水。各組大鼠均飼養(yǎng)在溫度(24±1)℃，濕度60%～80%的環(huán)境中。

1.3測量各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure，ICP)和血清睪酮水平

稱取適量戊巴比妥鈉，用生理鹽水稀釋成2%的溶液。腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉完全后，將大鼠仰臥位固定四肢和頭部。對大鼠頸部消毒后取正中切口，分離頸部肌群，找到并游離右頸總動脈。絲線結(jié)扎遠心端，近心端使用動脈夾夾閉，在中間取頸動脈小切口，插入充滿肝素化生理鹽水的PE-50導管，導管另一端連接壓力換能器，監(jiān)測大鼠平均頸動脈壓(mean artery pressure，MAP)。消毒大鼠腹部，取腹正中切口，找到大鼠前列腺背外側(cè)的陰莖海綿體神經(jīng)作為電刺激部位。剝離大鼠陰莖包皮，充分暴露大鼠陰莖海綿體，用充滿生理鹽水的25號穿刺針斜行刺入大鼠陰莖海綿體中，另一端連接壓力換能器，監(jiān)測大鼠ICP并記錄。連接到PowerLab工作臺，分別用2.5 V和5 V電壓刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)(頻率15 Hz，波寬1.2 ms，刺激1 min，間隔3 min)，記錄ICP和MAP的變化。

大鼠頸動脈測壓結(jié)束后，頸動脈取血3 mL，用睪酮測定試劑盒測量大鼠血清睪酮水平。處死大鼠，取大鼠陰莖，清除尿道海綿體和陰莖背靜脈等組織，用生理鹽水沖洗干凈后放于-80℃保存。

1.4Western blot檢測大鼠陰莖海綿體中S1P2/RhoA/Rho激酶的含量

將大鼠陰莖海綿體用組織剪剪碎后，加入RIPA裂解液。使用超聲波破碎蛋白后，放入4℃預冷離心機離心取上清液。用BCA法檢測提取蛋白的濃度，取總蛋白量50 μg，放入沸水中10 min。配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠準備電泳蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到0.45 nm的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于5%的BSA溶液中封閉2 h，封閉完成后分別放入對應的抗體中孵育過夜。取出后洗膜3次，每次10 min，然后按照說明書加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗，孵育1 h后再次洗膜3次，每次10 min，采用ECL化學發(fā)光并采集圖像進行處理，使用Quantity One軟件分析圖像結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1各實驗組大鼠生長情況和血清睪酮水平

去勢后4組大鼠均飼養(yǎng)8周，其中各組大鼠生長情況良好，無死亡情況出現(xiàn)，查各組大鼠血清睪酮水平B組[(1.34±0.62)nmol/L]較A組[(17.08±1.53)nmol/L]、C組[(15.47±1.62)nmol/L]和D組[(8.73±2.12)nmol/L]明顯降低(均P<0.05)。見圖1。

A組為對照組，B組為實驗組，C組為補充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖1　各組大鼠血清睪酮水平(n=10)Fig.1 The level of serum testosterone in rats in each group(n=10)

2.2大鼠海綿體測壓結(jié)果分析

分別用2.5 V和5 V電壓刺激大鼠海綿體神經(jīng)后，MaxICP/MAP結(jié)果2.5 V電壓刺激時B組(0.14±0.03)較A組(0.77±0.04)、C組(0.76±0.03)和D組(0.36±0.03)顯著降低(均P<0.05)；5 V電壓刺激時B組(0.19±0.03)較A組(0.83±0.04)、C組(0.82±0.04)和D組(0.47±0.04)顯著降低(均P<0.05)。圖2是各組大鼠在2.5 V和5 V刺激下海綿體測壓的ICP和MAP的監(jiān)測記錄和比較結(jié)果。

A：各組大鼠ICP和MAP監(jiān)測記錄；B：各組大鼠MaxICP/MAP結(jié)果(n=10)；A組為對照組，B組為實驗組，C組為補充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖2　各組大鼠在2.5 V和5 V電壓刺激下大鼠的ICP和MAP結(jié)果(n=10)Fig.2 Results of ICP and MAP in rats stimulated with voltage at 2.5 V and 5 V(n=10)

2.3Western blot檢測各組大鼠陰莖海綿體中S1P2/RhoA/ROCK通路的蛋白表達

結(jié)果顯示：B組S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2較A組、C組和D組明顯增高(均P<0.05)，見圖3。

A組為對照組，B組為實驗組，C組為補充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖3　Western blot檢測各組大鼠陰莖海綿體S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2蛋白表達水平(n=10)Fig.3 Western blot analysis of the expression of S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2 in the corpus cavernosum of rats(n=10)

3討論

陰莖海綿體內(nèi)皮細胞完整是陰莖正常勃起的保證[10]。完整的海綿體內(nèi)皮細胞不僅分泌血管舒張因子，而且分泌血管收縮因子，以調(diào)節(jié)陰莖的正常勃起及疲軟[10-12]。目前已有研究表明睪酮缺乏會直接或間接導致內(nèi)皮功能障礙[7，13-14]。內(nèi)皮細胞功能障礙的產(chǎn)生主要包括舒張血管因素減少和收縮血管因素增多：舒張血管的因素如eNOS及NO產(chǎn)生減少，而收縮血管的因素如內(nèi)皮素(endothelins，ETs)和RhoA/Rho激酶產(chǎn)生增多，導致正常陰莖海綿體舒張與收縮的平衡打破，最終導致ED[15-16]。

臨床研究表明，睪酮替代治療可以顯著改善血清睪酮水平較低的患者的勃起功能，但是其具體機制尚不清楚，目前關于睪酮替代治療改善勃起功能的機制研究多集中于eNOS途徑，而睪酮替代治療是如何影響陰莖海綿體內(nèi)的RhoA/Rho激酶途徑，從而發(fā)揮改善勃起功能的作用，相關研究較少。

RhoA/Rho激酶信號通路參與調(diào)控細胞增殖與凋亡、細胞形態(tài)維持、平滑肌收縮等多種生物學行為。RhoA是三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶的家族成員之一，主要以非活化的狀態(tài)與二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合，當GDP轉(zhuǎn)化成GTP后，RhoA從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜，進而激活其下游的信號分子：ROCK1和ROCK2。它們可以不依賴細胞內(nèi)Ca2+濃度促進肌動蛋白和肌球蛋白的交聯(lián)導致陰莖海綿體平滑肌的收縮[17-18]。在陰莖非勃起狀態(tài)下，RhoA/Rho激酶信號途徑通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的活性，催化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化水平增高，使陰莖海綿體平滑肌處于收縮狀態(tài)；而在勃起時，RhoA/Rho激酶信號途徑被抑制，從而引起海綿體平滑肌舒張[19-20]。

S1P是一種具有重要生理功能的信使分子，主要由血小板和紅細胞產(chǎn)生。它擁有5個G蛋白偶聯(lián)受體，為S1P1～S1P5，現(xiàn)有研究表明S1P2在人陰莖海綿體平滑肌細胞上有表達，當S1P結(jié)合S1P2受體后可以激活RhoA/Rho激酶途徑，進而使陰莖海綿體平滑肌收縮[8]。在用S1P誘導閹割大鼠的陰莖海綿體平滑肌肌條收縮的實驗中，發(fā)現(xiàn)隨著S1P劑量的增加及時間的延長，肌條收縮力隨之增大，然而，當用S1P誘導正常大鼠的陰莖海綿體平滑肌肌條收縮時，卻未見肌條明顯收縮[8]。以上的實驗研究結(jié)果可能是因為雄激素缺乏后，海綿體平滑肌上的S1P2受體增加，對S1P的敏感性增加，導致海綿體平滑肌強烈收縮，因此我們在實驗中提出了假設：雄激素缺乏將激活S1P/S1P2信號通路，進而激活RhoA/Rho激酶途徑，導致ED；當給予雄激素替代治療后，以上異常激活途徑將會被糾正，進而改善ED。

從實驗結(jié)果來看，B組的血清睪酮水平明顯低于其他組；相應的海綿體測壓的結(jié)果顯示B組相較于其他組顯著降低，低劑量的D組大鼠的勃起功能有所改善，但是還未達到正常水平，而高劑量的C組大鼠的勃起功能基本恢復正常，說明應用安特爾進行雄激素替代治療確實可以改善去勢大鼠的勃起功能；Western blot的結(jié)果顯示相比于其他組，B組S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2水平顯著升高，可知睪酮缺乏可以使S1P2表達上調(diào)，進而使RhoA/Rho激酶通路異常激活，引起陰莖海綿體平滑肌收縮，最終導致ED；而給予補充睪酮之后，這種異常激活途徑被糾正，S1P2表達下調(diào)，使RhoA/Rho激酶通路蛋白表達下降，從而改善ED。綜合來看，本實驗結(jié)論有助于闡明安特爾發(fā)揮作用的具體方式，并且為研究雄激素替代治療改善LOH相關ED的機制提供新的思路。

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(2015-09-16收稿)

Androgen Improves Erectile Dysfunction by Regulating RhoA/Rho-kinase in Castrated Rats

Cui Kai1，2，Li Rui1，2，Wang Tao1，2etal

1DepartmentofUrology，2InstituteofUrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo investigate the mechanism of androgen regulating RhoA/Rho-kinase to improve erectile dysfunction in castrated rats.MethodsForty eight-week-old healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group(group A)；experiment group(group B，in which rats were castrated)；intervention groups(groups C and D，in which rats were treated with different concentrations of testosterone undecanoate orally every day at 20 mg/kg and 10 mg/kg，respectively after being castrated).Animals in groups A and B were given 0.9% NS instead.After 8-week treatment，the level of serum testosterone，intracavernous pressure(ICP)and mean arterial pressure(MAP)were determined，and the expression of S1P2/RhoA/Rho-kinase detected in the penis by Western blot.ResultsThe level of serum testosterone was significantly lower in group B[(1.34±0.62)nmol/L]than in group A[(17.08±1.53)nmol/L]，group C[(15.47±1.62)nmol/L]and group D[(8.73±2.12)nmol/L](P<0.05 for all)；MaxICP/MAP was also lower in group B than in group A，group C and group D(P<0.05 for all)；the expression levels of S1P2/RhoA/Rho-kinase were higher in group B than in groups A，C and D(P<0.05 for all).ConclusionAndrogen replacement therapy can improve the erectile dysfunction by inhibiting the activation of S1P2/RhoA/Rho-kinase and thereby inhibiting the contraction of corpus cavernosum smooth muscle.

Key wordsRhoA/Rho-kinase；androgen；castration；erectile dysfunction

中圖分類號：R698.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.006

*國家自然科學基金資助項目(No.81200435)；中華醫(yī)學會臨床醫(yī)學科研專項資金資助項目(No.14020180555)

崔凱，男，1990年生，醫(yī)學碩士，E-mail：kaicui1990@yeah.net

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jhliu@tjh.tjmu.edu.cn(劉繼紅)；raokeke2009@163.com(饒可)