不同稀釋液對(duì)禽流感H5血清抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

殷紅梅

（廣元市農(nóng)業(yè)局，四川廣元 628000）

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不同稀釋液對(duì)禽流感H5血清抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

殷紅梅

（廣元市農(nóng)業(yè)局，四川廣元 628000）

［摘 要］本試驗(yàn)通過(guò)血液凝集抑制試驗(yàn)（HA）和血液凝集試驗(yàn)（HI）試驗(yàn)方法檢測(cè)禽流感H5抗體，分別使用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）和生理鹽水作為稀釋液，檢測(cè)待測(cè)3份未知血清樣品，1份已知陽(yáng)性血清和1份已知陰性血清，每份樣品做3個(gè)重復(fù)。經(jīng)χ2分析發(fā)現(xiàn)，PBS液組和生理鹽水組檢測(cè)結(jié)果差異性不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果證明，在日常監(jiān)測(cè)中可以使用生理鹽水替代PBS液作為稀釋液通過(guò)血凝及血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)禽流感H5血清抗體。

［關(guān)鍵詞］禽流感血凝及血凝抑制PBS液生理鹽水

當(dāng)前畜牧業(yè)特別是養(yǎng)禽業(yè)快速發(fā)展，活禽及禽產(chǎn)品交易頻繁，加劇了禽流感發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，2015年農(nóng)業(yè)部公布高致病性禽流感疫情10起，2016年公布2起，涵蓋家禽和野生鳥類，近期四川省成都市青羊區(qū)發(fā)生1起人感染禽流感H5N1病例。國(guó)家和地方加強(qiáng)禽流感防控工作力度，在強(qiáng)化免疫的同時(shí)，也加強(qiáng)了禽流感抗原抗體監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)頻次和數(shù)量逐年增加。按照國(guó)標(biāo)，禽流感抗體血凝及血凝抑制方法的緩沖液為PBS溶液。PBS溶液配備花的時(shí)間多，勞動(dòng)量大，不利于大規(guī)模檢測(cè)。在不影響檢測(cè)結(jié)果的前提下，能將緩沖液替換為生理鹽水，可以大大減輕勞動(dòng)量。

1　材料及方法

1.1試劑

PBS液（0.01mol/L，pH7.2）、阿氏液和生理鹽水（8.5g/ L）。阿氏液的配制方法為：葡萄糖20.5g，檸檬酸鈉8g，檸檬酸0.55g，NaCl4.2g，加水至1000ml。

1.2待檢血清和抗原

禽流感H5抗原及陽(yáng)性血清來(lái)源于哈維科生物；雞血清由廣元市昭化區(qū)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3檢測(cè)方法

PBS組按GB 19442-2004，生理鹽水組將GB 19442-2004所有使用的PBS液更換為生理鹽水。

2　結(jié)果

2.1血凝試驗(yàn)結(jié)果

使用PBS液和生理鹽水作為稀釋液，均有3個(gè)重復(fù)一個(gè)血凝單位為29倍，1個(gè)重復(fù)為28倍，兩個(gè)處理均按29倍作為一個(gè)血凝單位。

表1　不同稀釋液對(duì)禽流感H5血凝試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果

2.2血凝抑制結(jié)果

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組試驗(yàn)對(duì)血凝抑制結(jié)果差異性不顯著，P〉0.05。

3　討論

3.1影響HA和HI試驗(yàn)的因素

影響禽流感血凝及血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的因素有血清樣品質(zhì)量、器材選用、操作水平、稀釋液、結(jié)果判定。膠凍樣血清樣品可能導(dǎo)致樣品量不足或出現(xiàn)非特異性凝集；溶血樣品影響結(jié)果判定。微量反應(yīng)板對(duì)HA和HI試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)結(jié)果具體一定影響，鞏薇等認(rèn)為兔出血癥病毒HA和HI試驗(yàn)使用90℃V型板和一次性U型板［1］，禽流感防治技術(shù)規(guī)范（GB 19442-2004）和新城疫診斷技術(shù)規(guī)范（GB/T 16550-2008）要求HA和HI試驗(yàn)使用90℃V型板。操作水平包括移液器使用、抗原配制以及紅細(xì)胞洗滌等因素均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［2］。在環(huán)境溫度20℃～25℃，經(jīng)過(guò)15～30min即可讀出抗原效價(jià)和血清抗體滴度。當(dāng)溫度過(guò)低，出現(xiàn)結(jié)果慢；環(huán)境溫度過(guò)高，超過(guò)30℃時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)快，一旦時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)果就會(huì)消失，使整板無(wú)凝集現(xiàn)象。判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，將微量反應(yīng)板傾斜45℃，孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒者為凝集完全抑制；如果淚珠樣流淌線較細(xì)，可能是反應(yīng)時(shí)間不夠，需靜置一段時(shí)間再判讀。

表2　不同稀釋液對(duì)H5血凝抑制試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果

3.2不同稀釋液對(duì)HA和HI試驗(yàn)的影響

禽流感防治技術(shù)規(guī)范（GB 19442-2004）中HA和HI試驗(yàn)稀釋液為PBS液（0.01mol/L，PH7.2），新城疫診斷技術(shù)（GB/T 16550-2008）中HA和HI試驗(yàn)稀釋液為生理鹽水。孫淑清等認(rèn)為用PBS液（pH=7.2）測(cè)定的陽(yáng)性血清抗體滴度比用生理鹽水高出一孔。雷莉輝認(rèn)為pH=7.0時(shí)，紅細(xì)胞沉淀最充分，圖形最清晰。本試驗(yàn)在B樣品出現(xiàn)PBS液血凝抑制結(jié)果比生理鹽水高一孔，其他樣品結(jié)果基本一致，總體結(jié)果經(jīng)χ2分析差異性不顯著。

4　結(jié)論

日常監(jiān)測(cè)中可以使用生理鹽水替代PBS液作為稀釋液通過(guò)血凝（HA）及血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)禽流感H5血清抗體。

參考文獻(xiàn)

［1］ 鞏薇，衛(wèi)禮，付瑞.兔出血癥病毒血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)影響因素的探討［J］. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2003，（20）：7-10.

［2］ 常磊，孫婭莉，吳德喜，等.血凝和血凝抑制試驗(yàn)的影響因素［J］.中國(guó)家禽，2011，（16）：57-58.