歸腎丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠白細(xì)胞介素-17 和白細(xì)胞介素-1β 水平的影響

黃小瓊, 黃 威, 朱穎欣, 劉月姝, 黃小紅, 樓彩霞, 鄺少松, 黃淑堅(jiān)

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 佛山 528248; 2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 佛山 528248）

歸腎丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠白細(xì)胞介素-17 和白細(xì)胞介素-1β 水平的影響

黃小瓊1, 黃 威1, 朱穎欣1, 劉月姝1, 黃小紅1, 樓彩霞1, 鄺少松1, 黃淑堅(jiān)2

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 佛山 528248; 2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 佛山 528248）

目的 探討歸腎丸對(duì)免疫性卵巢早衰(POF)小鼠血清白細(xì)胞介素-17(IL-17)和白介素-1β (IL-1β)水平的影響。方法 采用小鼠透明帶多肽抗原免疫小鼠，建立免疫性(POF)小鼠模型。歸腎丸灌胃干預(yù)4周，取小鼠血清用ELISA法檢測(cè)IL-17; 取卵巢組織，行HE染色，觀察卵泡形態(tài);用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)卵巢IL-1β。結(jié)果 與模型組比較, 正常對(duì)照組、戊酸雌二醇組(陽(yáng)性對(duì)照)、歸腎丸高、中和低劑量組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值均有顯著減少(P＜0.01);正常對(duì)照組和戊酸雌二醇組血清IL-17有顯著減少(P＜0.01)，高、中和低劑量組血清IL-17有顯著減少(P＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組卵母細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值呈顯著增加(P＜0.01)，其他各組均無(wú)顯著差異(P＞0.05); 模型組、戊酸雌二醇組、高劑量組、中劑量組和低劑量組顆粒細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均光密度值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 模型組、戊酸雌二醇組、高劑量組、中劑量組和低劑量組血清IL-17均呈顯著性增加(P＜0.01)。結(jié)論 歸腎丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β和IL-17改善小鼠自身免疫紊亂，從而改善卵巢卵泡功能。

歸腎丸; 自身免疫性卵巢早衰(POF); 白細(xì)胞介素-17(IL-17); 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)

40歲前的婦女出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素水平升高、雌激素缺乏等癥狀，臨床上稱為卵巢早衰(premature ovarian failure, POF), 其發(fā)病率在1%～3%, 近年來(lái)有升高的趨勢(shì)。該病發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明, 是婦科和生殖醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)之一[1～3]。激素治療雖然可以改善癥狀，但易引起癌變并具有毒副作用，所以諸多學(xué)者開(kāi)始尋求采用中藥治療的方法。有文獻(xiàn)[4]報(bào)道用歸腎丸可治療POF、月經(jīng)過(guò)少等疾病。目前研究[5]表明 POF與自身免疫紊亂密切相關(guān)，細(xì)胞因子在對(duì)生殖生理的調(diào)控中，不僅能影響卵巢激素分秘、卵泡形成和孕卵著床，還參與子宮內(nèi)膜的重建修復(fù)等過(guò)程；作為免疫與內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個(gè)重要連接因子，細(xì)胞因子在女性生殖生理及卵巢激素調(diào)節(jié)、卵巢排卵中均起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討歸腎丸對(duì)POF的免疫作用機(jī)制，試圖為研究歸腎丸治療POF藥效提供理論基礎(chǔ)和疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠70只, 18～22 g, 由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(粵)2013-0002]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和儀器試劑

歸腎丸湯劑為自制水提物，主要中藥成分為菟絲子、黃芪、黨參、枸杞子、杜仲、淫羊藿、女貞子、柴胡、丹參、炙甘草。歸腎丸臨床擬用量為每日2.55 g/kg，設(shè)中劑量組為小鼠等效劑量(臨床用量的10倍), 即每日25.5 g/kg; 高劑量為臨床用量的20倍，即每日51 g/kg; 低劑量為臨床用量的5倍，即每日12.75 g/kg。按配方比例取153 g中藥加1 530 mL的水煎煮，燒開(kāi)后慢火煎煮1 h，倒出藥液。藥渣再加1 530 mL水煎煮，燒開(kāi)后慢火煎煮1 h，倒出藥液。合并兩次煎煮藥液，濃縮至60 mL，獲得濃度為2.55 g/mL的歸腎丸中藥,用于高劑量組給藥; 小鼠透明帶多肽抗原: 批號(hào)，CO-06-02823, 中肽生化有限公司; 戊酸雌二醇片: 批號(hào): 081A2, 拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司。主要儀器、試劑: BX41型熒光顯微鏡: 日本Olympus; DG5033A型酶標(biāo)儀: 南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司; RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī): Leica@，德國(guó); BX43型生物顯微鏡: Olympus@CellSensStandard顯微圖像軟件: Olympus@，日本; HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng): 武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司; 白細(xì)胞介素17(IL-17)酶聯(lián)免疫試劑盒: 批號(hào): N03019729，武漢華美生物工程有限公司; 抗白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)抗體: 批號(hào): GR1134-40，Abcam公司; 兔IgG試劑盒: 批號(hào): 10L03A, 博士德生物技術(shù)有限公司; DAB顯色試劑盒: 博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠按完全隨機(jī)法分為正常對(duì)照組10只，造模組60只，正常對(duì)照組注射生理鹽水，造模組按文獻(xiàn)方法[6]造模, 造模成功后, 按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法,分為5組, 模型組、戊酸雌二醇組(0.3 mg/kg, 陽(yáng)性對(duì)照)、歸腎丸高、中、低劑量組, 每組12只。模型組不作處理，戊酸雌二醇組、高、中、低劑量組均于第3次免疫后給藥，各劑量組灌胃給予歸腎丸湯劑，0.2 mL/10 g，共灌胃4周。灌胃結(jié)束后采全血，3 000 r/min離心，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清IL-17; 取血后，立即頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠卵巢用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，HE染色，觀察卵泡形態(tài); 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢細(xì)胞因子IL-1β。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x-±s表示，單因素方差分析進(jìn)行模型組與各給藥組間差異的顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)卵泡形態(tài)的影響

光鏡下觀察小鼠卵巢各級(jí)卵泡形態(tài)見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組小鼠卵巢色澤紅潤(rùn)，成熟卵泡顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液很豐富(圖1A)。模型組小鼠卵巢內(nèi)見(jiàn)多量閉鎖卵泡，卵母細(xì)胞固縮，卵泡的顆粒細(xì)胞排列極紊亂(圖1B)。戊酸雌二醇組成熟卵泡的顆粒細(xì)胞排列稍紊亂，有少量的閉鎖卵泡(圖1C)。高劑量組可見(jiàn)成熟卵泡，卵泡液很豐富，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，層次多。(圖1D)。中劑量組卵泡顆粒細(xì)胞層次較多，排列稍紊亂，卵泡液豐富，也可見(jiàn)少量閉鎖卵泡(圖1E)。低劑量組成熟卵泡的顆粒細(xì)胞排列稍紊亂，仍有較多的閉鎖卵泡(圖1F)。

2.2 對(duì)卵巢IL-1β和血清IL-17的影響

結(jié)果表明(表1)，與模型組比較，各組卵母細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β吸光度值顯著減少(P＜0.01)，而顆粒細(xì)胞卵泡液內(nèi)IL-1β吸光度值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 與模型組比較，各組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.01或P＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組卵母細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β吸光度值顯著增加(P＜0.01)，其他各組均無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 各組IL-17均顯著增加(P＜0.01)。

3 討論

POF的免疫紊亂表現(xiàn)在卵巢的組織學(xué)及各種自身抗體、細(xì)胞因子、免疫蛋白、T 淋巴細(xì)胞亞群的變化等幾個(gè)方面。以往的研究表明[7]，免疫性卵巢早衰患者表現(xiàn)為T(mén)h17細(xì)胞的過(guò)度激活和Treg細(xì)胞過(guò)度減少。Th17細(xì)胞是表達(dá)IL-17的CD4+T細(xì)胞，通常認(rèn)為IL-17是眾多促炎因子之一, IL-17介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，使機(jī)體受到損傷。有文獻(xiàn)[8]報(bào)道，卵巢早衰小鼠IL-17、IL-6明顯增高, 可以作為卵巢早衰小鼠免疫損傷度的檢測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 與模型組比較，正常對(duì)照組和戊酸雌二醇組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.01)，高劑量組、中劑量組和低劑量組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.05)。

圖1 歸腎丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡形態(tài)的影響(HE× 400)

表1 歸腎丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵巢IL-1β和血清IL-17的影響 ng/L

正常生理情況下，卵泡刺激素(FSH)促進(jìn)血單核細(xì)胞分泌IL-Iβ，誘導(dǎo)卵細(xì)胞成熟，黃體生成激素(LH)則促進(jìn)IL-Iβ在人黃素化顆粒細(xì)胞上的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 調(diào)節(jié)卵巢表面類固醇的生成，參與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。IL-1β有較強(qiáng)的抗促性腺激素作用, 可阻斷顆粒細(xì)胞分泌孕酮(P) 和形成LH 受體, 并通過(guò)抑制雌激素、P、雄激素和LH 受體的形成, 阻止卵泡閉鎖。當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)免疫紊亂，表現(xiàn)為IL-1β過(guò)度增強(qiáng)或下降時(shí)，卵泡的發(fā)育及閉鎖受到影響，分泌雌、孕激素下降，出現(xiàn)排卵障礙，卵泡閉鎖加速, 而卵泡閉鎖的加速是POF 的發(fā)病原因之一。

Karagouni等[10]報(bào)道，采用ELISA方法檢測(cè)血清和卵泡液IL-1β, 顯示卵泡液中IL-1β的水平明顯增高，提示 IL-1β主要表達(dá)在卵巢。路帥[11]報(bào)道,排卵障礙模型大鼠卵巢組織中IL-1β、TNF-α、TGF-β1及 TGF-βR1蛋白的水平較正常組均顯著升高，提示它們與卵巢排卵功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 模型組小鼠卵巢內(nèi)見(jiàn)大量閉鎖卵泡，卵母細(xì)胞固縮, 生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡極少, 卵泡的顆粒細(xì)胞排列極紊亂，提示本實(shí)驗(yàn)采用小鼠多肽抗原成功建立了POF模型。與模型組比較，對(duì)照組、戊酸雌二醇組、歸腎丸高、中和低劑量組卵母細(xì)胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值顯著性減少(P＜0.01);而陰性對(duì)照組、戊酸雌二醇組、歸腎丸高、中和低劑量組顆粒細(xì)胞卵泡液內(nèi)IL-1β平均光密度值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，提示免疫性POF小鼠可能出現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)紊亂，IL-1β主要在卵巢的卵母細(xì)胞液有高表達(dá), 歸腎丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β和IL-17改善自身免疫紊亂。

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R285.5 Q95-33

B

1674-5817(2016)05-0387-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.013

2016-05-22

廣東省中醫(yī)藥管理局課題(20132105), 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B050500006)

黃小瓊(1973-), 女, 高級(jí)獸醫(yī)師, 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和

比較醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail: 842576040@qq.com. [通訊作者] 黃淑堅(jiān)(1966-), 男, 教授, 動(dòng)物傳染病診斷和防治。

E-mail: 617955368@qq.com.

鄺少松(1973-), 女, 高級(jí)獸醫(yī)師, 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和比較醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail: 793053642@qq.com