Toll樣受體2、4、5在幽門螺桿菌相關(guān)胃黏膜病變中的表達

秦凱凱，黃俊謙，初蕾蕾，崔艷欣，黃新剛，姜相君

大連醫(yī)科大學附屬青島市市立醫(yī)院 1. 消化內(nèi)二科；2. 呼吸內(nèi)科；3. 病理科，山東 青島 266011

Toll樣受體2、4、5在幽門螺桿菌相關(guān)胃黏膜病變中的表達

秦凱凱1，黃俊謙2，初蕾蕾1，崔艷欣1，黃新剛3，姜相君1

大連醫(yī)科大學附屬青島市市立醫(yī)院 1. 消化內(nèi)二科；2. 呼吸內(nèi)科；3. 病理科，山東 青島 266011

目的 探討Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)2、4、5及髓樣分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)表達在H.pylori相關(guān)的胃炎與胃潰瘍(gastric ulcer,GU)病變免疫反應(yīng)中的作用。方法 選取青島市常住居民中慢性胃炎198例、GU 82例、對照組90名。根據(jù)快速尿素試驗及Giemsa確定各組H.pylori感染率；并利用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)技術(shù)分析各組的各個基因mRNA的表達。結(jié)果 GU組、胃炎組、對照組三組之間的H.pylori感染率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.95，P<0.01)。H.pylori陽性組中TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB的mRNA表達明顯高于H.pylori陰性組(P<0.001)；H.pylori一致時，GU組TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表達量明顯高于胃炎組及對照組(P<0.01)。結(jié)論H.pylori相關(guān)的胃炎與GU的發(fā)病可能與H.pylori通過TLR途徑作用于機體免疫系統(tǒng)有關(guān)。

胃炎；胃潰瘍；Toll樣受體；髓樣分化因子88；幽門螺桿菌

胃炎及胃潰瘍(gastric ulcer，GU)是常見的嚴重影響人們健康的胃黏膜疾病，目前普遍認為幽門螺桿菌(H.pylori)、藥物、飲酒、不良生活方式等是造成胃黏膜的初始因素[1]。其中H.pylori感染被認為是造成胃黏膜病變的主要微生物因素[2]。H.pylori是一種革蘭氏陽性、有鞭毛的微需氧型細菌。目前全球有超過一半人感染H.pylori，而發(fā)展中國家可能高達70%～80%，然而研究表明在感染H.pylori人群中只有一小部分能夠發(fā)展為胃炎，約10%發(fā)展為GU[3]。至今H.pylori引起胃黏膜疾病的作用機制仍不清楚。既往研究顯示胃黏膜病變的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸與機體的天然和獲得性免疫應(yīng)答之間的相互作用有關(guān)。近幾年，天然免疫在胃黏膜疾病中的作用日益受到重視。目前發(fā)現(xiàn)Toll樣受體家族(Toll-like receptors,TLRs)作為重要的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，在啟動天然免疫、調(diào)節(jié)獲得性免疫方面具有重要作用；它們表達于正常組織細胞中，參與組織的損傷和修復過程[4]，通過對細菌脂蛋白、脂肽等產(chǎn)物的特異性識別啟動下游的信號活化，從而引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。在研究TLRs的信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)現(xiàn)MyD88是啟動信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵信號分子，能夠活化NF-κB進而介導炎癥因子基因的表達，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而導致疾病[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中存在13個成員，包括TLR1～13。但近幾年在動物及細胞試驗中發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4、TLR5可能在H.pylori相關(guān)的胃黏膜損傷過程中發(fā)揮著一定的作用[6]，而在人體中的不同研究結(jié)果卻相差甚遠[7]。因此，至今也沒有形成系統(tǒng)的理論能夠解釋H.pylori在胃黏膜疾病過程中的作用及機制。本研究選取青島市市北區(qū)居民為研究對象，探討TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB與H.pylori相關(guān)的胃炎與GU發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月-2014年7月于青島市市立醫(yī)院內(nèi)鏡中心接受胃鏡檢查的青島市市北區(qū)居民為研究對象，根據(jù)胃鏡檢查結(jié)果進行分組，診斷標準參見慢性胃炎的內(nèi)鏡分型分級標準[8]，最終選取慢性胃炎組198例，男96例，女102例，年齡25～77歲，平均年齡(48±11)歲；GU組82例，男45例，女37例，年齡30～75歲，平均年齡(48±13)歲。選擇同期健康體檢者90名作為對照組，男45名，女45名，年齡20～70歲，平均年齡(49±14)歲。三組人群年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。各組人群的排除標準包括：(1)年齡<20歲或>80歲者；(2)有嚴重的其他系統(tǒng)疾病者(包括惡性腫瘤)；(3)各種嚴重感染患者；(4)患有其他嚴重消化系統(tǒng)疾??；(5)曾經(jīng)進行過抑酸、抗H.pylori等相關(guān)治療者；(6)近半年內(nèi)長期服用NSAID藥物者。所有研究對象在試驗前均知情所做檢查及相關(guān)檢測，同意并簽署知情同意書，所進行實驗操作遵守赫爾辛基宣傳守則。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學檢查及H.pylori檢測：通過胃鏡對研究對象鉗取4塊胃黏膜組織，胃炎組、GU組選取病變部位，對照組選取胃竇及胃體部各2塊。所有標本均隨機選取2塊組織置于RNA保存液中后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＪＳ?塊組織，其中1塊用于快速尿素酶試驗，1塊經(jīng)過HE染色及Giemsa染色，然后進行病理學檢查及H.pylori測定，組織病理學的分級評價標準參見更新的悉尼評價系統(tǒng)[8]?？焖倌蛩孛冈囼灱敖M織學進行H.pylori檢測，兩項均為陽性即判斷為感染H.pylori，均為陰性即判定為H.pylori非感染者，其他的剔除研究。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成：利用低溫凍存的2塊組織，解凍后按照RNA提取試劑盒的說明書逐步進行組織總RNA提取。所得到的總RNA取5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量PCR：目的基因和內(nèi)參分別在不同的PCR管中進行擴增。引物序列[9-11]如表1所示。PCR擴增條件為：94 ℃預變性1 min，94 ℃ 8 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，最后是72 ℃ 10 min延伸，反應(yīng)結(jié)束后對每一份標本均行復管檢測，取其均值作為目的基因的表達水平，相對定量2-ΔΔct法分析結(jié)果。

表1 各因子的引物序列Tab 1 Primer sequence of each factor

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)鏡及病理檢查結(jié)果 通過胃鏡發(fā)現(xiàn)，胃炎組可見正常黏膜間有散在的水腫、糜爛、出血的斑塊[8]；GU患者表現(xiàn)為黏膜破損較深、多有白苔附著，周圍有充血、水腫，并應(yīng)用NBI模式初步排除癌變可能；對照組鏡下黏膜紅潤光滑，無充血、水腫及滲出等表現(xiàn)。病理結(jié)果：黏膜組織間不同程度的炎癥細胞浸潤，根據(jù)內(nèi)鏡下及顯微鏡下隨機視野炎癥細胞浸潤情況將胃炎組分為輕度、中度、重度三組[8]及GU組和對照組，其中胃炎組198例(輕度68例、中度70例、重度60例)，GU組82例，對照組90例(見圖1～2)。

圖1 各組內(nèi)鏡檢查結(jié)果；圖2 各組病理檢查結(jié)果 A：對照組；B：GU組；C：重度胃炎組；D：中度胃炎組；E：輕度胃炎組
Fig 1 The results of endoscopy in each group; Fig 2 The results of pathology in each group A: control group; B: GU group; C: severe gastritis group; D: moderate gastritis group; E: mild gastritis group

2.2H.pylori感染率 胃炎組122例(61.6%)感染(輕度38例、中度42例、重度42例)H.pylori；GU組61例(74.4%)感染H.pylori；對照組42例(46.7%)感染H.pylori。胃炎組、GU組、對照組三組之間H.pylori感染率相比，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.95，P<0.01)，且胃炎組明顯高于對照組(P=0.018)，GU組高于對照組(P<0.001)；GU組明顯高于胃炎組(P<0.05)，胃炎組中輕、中、重各組之間H.pylori感染率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB mRNA的表達 在H.pylori陽性組中對照組、胃炎組及GU組的TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表達量明顯高于H.pylori陰性組(見表2～4)；H.pylori陽性胃炎組中的輕、中、重度TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表達量明顯高于H.pylori陰性組。在H.pylori陽性組及陰性組內(nèi)，TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表達量與組織的炎癥浸潤有明顯的關(guān)聯(lián)：GU組明顯高于胃炎組及對照組，胃炎組明顯高于對照組；但是在輕、中、重度胃炎內(nèi)部只有TLR2、TLR4的表達有意義；TLR5 mRNA在各組之間表達的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表5～6)。

表2 各組TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB的mRNA表達量

表3 輕、中、重胃炎組TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB的mRNA表達量Tab 3 The mRNA expressions of TLR2,TLR4,TLR5,MyD88 and NF-κB in the different gastritis groups ±s)

表4 H.pylori陽性組與H.pylori陰性組之間各組TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB mRNA表達量的比較Tab 4 Comparison of the mRNA expressions of TLR2,TLR4,TLR5,MyD88 and NF-κB between H.pylori positive group and negative groups

3 討論

正常的胃黏膜能夠通過自身的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及產(chǎn)生的活性物質(zhì)抵抗有害因子的損傷。當攻擊因子與防御因子失去平衡后就會導致疾病[12]。TLR是一類I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeat，LRR)識別不同配體，Akira等[13]通過對基因缺陷小鼠的研究證實，不同的TLR能夠識別不同的PAMPs。如TLR2識別革蘭氏陽性細菌等病原體的PAMPs，TLR4主要識別革蘭氏陰性細菌細胞膜上的LPS等，TLR5可識別病原菌的鞭毛蛋白。胞內(nèi)區(qū)稱為Toll/IL-1受體同源區(qū)TIR(TLR/IL-1 homologous region)，其結(jié)構(gòu)高度保守是啟動信號轉(zhuǎn)導的重要關(guān)卡。

由于H.pylori的多樣性及人種的差異，H.pylori感染后不同人種的免疫應(yīng)答也大不相同?，F(xiàn)已明確表達在細胞表面的TLRs被不恰當?shù)募せ詈髤⑴c組織的損傷與修復[14]。機體在對抗病原體感染的過程中TLR2、TLR4的表達能夠被上調(diào)，通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細胞的共刺激分子的表達，引導前T細胞分化為Th1、Th2細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并通過調(diào)節(jié)性T細胞介導免疫應(yīng)答，促進促炎因子的釋放[15]。在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)H.pylori中的LPS能夠被TLR2、TLR4識別并能夠通過激活NF-κB而活化細胞核內(nèi)炎癥基因的表達，進而促進炎癥因子的釋放。另外，在研究TLR2、TLR4的基因多態(tài)性時發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4突變型在H.pylori感染后其表達量較野生型明顯下降，這些證據(jù)也從側(cè)面反映了TLR2、TLR4在對抗H.pylori感染中的作用。Lpez-Yglesias等[16]在研究鞭毛細菌的致病過程中發(fā)現(xiàn)了細菌的鞭毛蛋白能夠被TLR5識別且通過MyD88信號通路激活免疫應(yīng)答，增強T細胞與B細胞的免疫應(yīng)答能力。由此我們推測H.pylori也能夠通過其自身的鞭毛蛋白與TLR5作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，Mori等[17]已經(jīng)在細胞方面研究中證實了這一點。人們在探索TLR信號轉(zhuǎn)導的過程中發(fā)現(xiàn)MyD88能夠招募激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)隨后產(chǎn)生系列的級聯(lián)反應(yīng)活化NF-κB等調(diào)控因子的表達，促進促炎因子轉(zhuǎn)錄與表達的增加而MyD88非依賴途徑能夠遲發(fā)的活化NF-κB產(chǎn)生免疫應(yīng)答[18]。

表5 H.pylori陽性組各組TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB mRNA表達量的比較Tab 5 Comparison of the mRNA expressions of TLR2,TLR4,TLR5,MyD88 and NF-κB among the different groups in the H.pylori positive group

表6 H.pylori陰性組各組TLR2、TLR4、TLR5、MyD88及NF-κB mRNA表達量的比較Tab 6 Comparison of the mRNA expressions of TLR2,TLR4,TLR5,MyD88 and NF-κB among the different groups in the H.pylori negative group

本研究通過采用實時定量PCR技術(shù)對各組胃黏膜組織中的TLR2、TLR4、TLR5、NF-κB及MyD88的表達情況進行定量分析。發(fā)現(xiàn)在正常的黏膜中有一定量的TLRs的mRNA表達，但是由于TLRs抑制蛋白(Tollip)的作用而不會造成炎癥損傷[19]。我們可以得出結(jié)論：H.pylori感染在胃黏膜疾病的起始與進展中發(fā)揮重要的作用，它通過上調(diào)TLR2、TLR4的表達，啟動MyD88并進一步活化NF-κB介導的免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥細胞、炎癥因子導致炎癥損傷。Tan等[20]的研究證實TLRs能夠活化中性粒細胞并能夠延長中性粒細胞的生存時間，促進其活化和殺傷功能，而我們的研究結(jié)果驗證了此觀點。然而，在H.pylori陽性組與陰性組均存在TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表達量中GU組顯著高于胃炎組及對照組、胃炎組高于對照組，說明TLRs在由非H.pylori感染引起的胃黏膜病變中同樣能夠誘導免疫應(yīng)答，且在疾病的進展過程中能夠產(chǎn)生級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)而加重疾病[15]，而H.pylori感染能夠進一步加強這種作用。本研究結(jié)果顯示TLR5的表達在各組之間并沒有較大的變化，證明H.pylori的鞭毛蛋白在其致病過程中可能并未發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是也可能是由于H.pylori亞型的差異及人種的差異造成了TLR5對H.pylori鞭毛蛋白的耐受，而造成TLR5對H.pylori鞭毛蛋白的無應(yīng)答。

總之，H.pylori能夠通過PAMP啟動TLR2、TLR4并介導炎癥反應(yīng)，可能通過某種正反饋機制上調(diào)TLR2、TLR4的表達，進一步放大炎癥信號的傳遞而造成疾病的形成。目前，在自身免疫性疾病及研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLR的拮抗劑能夠有效地控制疾病的進展。因此，進一步研究TLR與H.pylori引起的胃黏膜病變的識別、信號轉(zhuǎn)導、基因表達的信號調(diào)控等機制，能更深入地揭示H.pylori感染與機體抗感染的免疫應(yīng)答機制，并有可能為治療疾病提供可靠的理論依據(jù)。

[1]Kemmerly T,Kaunitz JD. Gastroduodenal mucosal defense [J]. Curr Opin Gastroenterol,2013,29(6): 642-649.

[2]Testerman TL,Morris J. Beyond the stomach: an updated view of Helicobacter pylori pathogenesis,diagnosis and treatment [J]. World J Gastroenterol,2014,20(36): 12781-12808.

[3]Wen S,Moss SF. Helicobacter pylori virulence factors in gastric carcinogenesis [J]. Cancer Lett,2009,282(1): 1-8.

[4]Imani Fooladi AA,Mousavi SF,Seghatoleslami S,et al. Toll-like receptors: role of inflammation and commensal bacteria [J]. Inflamm Allergy Drug Targets,2011,10(3): 198-207.

[5]Obonyo M,Rickman B,Guiney DG. Effects of myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) activation on Helicobacter infection in vivo and induction of a Th17 response [J]. Helicobacter,2011,16(5): 398-404.

[6]Sayi A,Kohler E,Toller IM,et al. TLR-2-activated B cells suppress Helicobacter-induced preneoplastic gastric immunopathology by inducing T regulatory-1 cells [J]. J Immunol,2011,186(2): 878-890.

[7]O’Connor PM,Lapointe TK,Jackson S,et al. Helicobacter pylori activates calpain via toll-like receptor 2 to disrupt adherens junctions in human gastric epithelial cells [J]. Infect Immun,2011,79(10): 3887-3894.

[8]The Chinese medical association digestion epidemiology branch,Fang JY,Liu WZ,et al. Chinese national consensus on chronic gastritis (2012,Shanghai) [J]. Chin J Dig,2013,33(1): 5-16. 中華醫(yī)學會消化病學分會,房靜遠,劉文忠,等. 中國慢性胃炎共識意見(2012年，上海)[J]. 中華消化雜志,2013,33(1): 5-16.

[9]Kim GT,Cho ML,Park YE,et al. Expression of TLR2,TLR4,and TLR9 in dermatomyositis and polymyositis [J]. Clin Rheumatol,2010,29(3): 273-279.

[10]Pu D,Wang W. Toll-like receptor 4 agonist,lipopolysaccharide,increases the expression levels of cytokines and chemokines in human peripheral blood mononuclear cells [J]. Exp Ther Med,2014,8(6): 1914-1918.

[11]Jesic S,Jotic A,Tomanovic N,et al. Expression of toll-like receptors 2,4 and nuclear factor kappa B in mucosal lesions of human otitis: pattern and relationship in a clinical immunohistochemical study [J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,2014,123(6): 434-441.

[12]Brzozowska I,Ptak-Belowska A,Pawlik M,et al. Mucosal strengthening activity of central and peripheral melatonin in the mechanism of gastric defense [J]. J Physiol Pharmacol,2009,60 Suppl 7: 47-56.

[13]Akira S,Uematsu S,Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity [J]. Cell,2006,124(4): 783-801.

[14]Papadimitraki ED,Bertsias GK,Boumpas DT. Toll-like receptors and autoimmunity: a critical appraisal [J]. J Autoimmun,2007,29(4): 310-318.

[15]Kim GT,Cho ML,Park YE,et al. Expression of TLR2,TLR4,and TLR9 in dermatomyositis and polymyositis [J]. Clin Rheumatol,2010,29(3): 273-279.

[16]López-Yglesias AH,Zhao X,Quarles EK,et al. Flagellin induces antibody responses through a TLR5- and inflammasome-independent pathway [J]. J Immunol,2014,192(4): 1587-1596.

[17]Mori J,Vranac T,Smrekar B,et al. Chimeric flagellin as the self-adjuvanting antigen for the activation of immune response against Helicobacter pylori [J]. Vaccine,2012,30(40): 5856-5863.

[18]Han J. MyD88 beyond Toll [J]. Nat Immunol,2006,7(4): 370-371.

[19]Pimentel-Nunes P,Soares JB,Roncon-Albuguergue R Jr,et al. Toll-like receptors as therapeutic targets in gastrointestinal diseases [J]. Expert Opin Ther Targets,2010,14(4): 347-368.

[20]Tan Y,Zou KF,Qian W,et al. Expression and implication of toll-like receptors TLR2,TLR4 and TLR9 in colonic mucosa of patients with ulcerative colitis [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2014,34(5): 785-790.

(責任編輯：陳香宇)

Expression of Toll-like receptor 2,4,5 in the gastric mucosal lesions with Helicobacter pylori infection

QIN Kaikai1,HUANG Junqian2,CHU Leilei1,CUI Yanxin1,HUANG Xingang3,JIANG Xiangjun1

1.Department of No.2 Gastroenterology; 2.Department of Respiratory; 3.Department of Pathology,Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Dalian Medical University,Qingdao 266011,China

Objective To investigate the role of Toll-like receptor 2 (TLR2),TLR4,TLR5 and the signaling pathways in the gastric mucosa diseases induced by observing the patients withH.pyloriinfection. Methods Biopsy specimens were obtained from the gastric mucosa of 198 patients with gastritis,82 patients with gastric ulcer (GU) and 90 healthy persons by the gastroscopy. Rapid urea test and Giemsa staining were performed to observe the infection rates ofH.pylori. The expressions of TLR2,TLR4,TLR5,NF-κB and MyD88 mRNAs were detected by Real-time PCR. Results The infection rates ofH.pyloriin GU group,gastritis group and control group were 74.4%,61.6%,46.7%,there was significant difference (χ2=13.95,P<0.01). The expression levels of TLR2,TLR4,NF-κB and MyD88 mRNA were significantly higher in theH.pyloripositive group than theH.pylorinegative group (P<0.001). Smilarly,no matter in theH.pyloripositive group or in theH.pylorinegative group,the expressions of TLR2,TLR4,NF-κB and MyD88 mRNAs in GU group were higher than gastritis group and control group (P<0.01). ConclusionH.pylorimay induce the begin and development of the gastric mucosal diseases by upregulating the expression and the signal transduction of TLRs.

Gastritis; Gastric ulcer; Toll-like receptors; Myeloid differentiation factor 88; Helicobacter pylori

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.021

秦凱凱，碩士在讀，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診斷及治療。E-mail：qkk1989@163.com

姜相君，教授，博士生導師，主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診斷及治療。E-mail：drjxj@163.com

R735.3+5

A

1006-5709(2016)02-0193-05

2015-03-25