自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響

張　帆，武創(chuàng)新，齊帥英，易華婭

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2. 甘肅省華亭縣人民醫(yī)院，甘肅 華亭 744000；3. 遼寧省撫順市中醫(yī)院，遼寧 撫順 113008；4. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

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論著

自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響

張帆1，武創(chuàng)新2，齊帥英3，易華婭4

(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2. 甘肅省華亭縣人民醫(yī)院，甘肅 華亭 744000；3. 遼寧省撫順市中醫(yī)院，遼寧 撫順 113008；4. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

[摘要]目的探討自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影響。方法選用自然老化的圍絕經(jīng)期雌性SD大鼠，臀部肌肉左右交替肌注氫化可的松構(gòu)建腎陽虛型圍絕經(jīng)期大鼠模型，將造模成功大鼠隨機(jī)分為更年湯組、教材方組、利維愛組、生理鹽水組；另選擇4月齡SD雌性大鼠20只作為青年組，18月齡SD雌性大鼠20只作為老年組。青年組、老年組、生理鹽水組均給予生理鹽水灌胃，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃15 d后處死大鼠，分離摘取雙側(cè)卵巢，運(yùn)用病理切片觀察卵巢組織大體形態(tài)，運(yùn)用免疫組化及原位雜交法檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果各給藥組卵泡發(fā)育良好情況優(yōu)于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)，卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況輕于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)；自擬更年湯組與利維愛組卵泡發(fā)育良好情況優(yōu)于教材方組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；自擬更年湯組卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況輕于教材方組和利維愛組(P均<0.05)，教材方組與利維愛組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各給藥組bax、bax mRNA陽性表達(dá)明顯低于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)，bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)明顯高于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)；自擬更年湯組與利維愛組bax、bax mRNA陽性表達(dá)明顯低于教材方組(P均<0.05)，bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)明顯高于教材方組(P均<0.05)，自擬更年湯組bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA陽性表達(dá)與利維愛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論自擬更年湯能促進(jìn)卵泡發(fā)育，抑制卵泡閉鎖和擴(kuò)張，能上調(diào)卵巢顆粒細(xì)胞抑制凋亡因子bcl-2、bcl-2 mRNA的陽性表達(dá)，抑制促凋亡因子bax、bax mRNA的陽性表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]自擬更年湯；圍絕經(jīng)期；腎陽虛；細(xì)胞凋亡因子

絕經(jīng)期綜合征是45～55歲女性的常見病，且近年來隨著現(xiàn)代女性經(jīng)濟(jì)地位的提高，生活壓力的增大，大環(huán)境的改變，使此病的發(fā)生有逐年上升的趨勢(shì)?，F(xiàn)在許多學(xué)者將細(xì)胞凋亡理論作為絕經(jīng)期綜合征的研究熱點(diǎn)。本研究觀察了自擬更年湯對(duì)腎陽虛型圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)及顆粒細(xì)胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影響，旨在為自擬更年湯治療絕經(jīng)期綜合征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)藥品自擬更年湯，組方：熟地12 g、懷山藥12 g、棗皮12 g、仙茅12 g、仙靈脾12 g、巴戟天12 g、女貞子12 g、旱蓮草12 g、桑寄生12 g、當(dāng)歸10 g、 桂枝9 g、獨(dú)活9 g、防風(fēng)9 g、細(xì)辛3 g、炙甘草6 g。教材方，組方：熟地、仙茅、仙靈脾各15 g，山藥、杜仲、棗皮、菟絲子、知母各12 g，黃柏、當(dāng)歸各10 g，肉桂、甘草各6 g。生理鹽水： 250 mL/2.25 g，貴州省科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033939。替勃龍片： 2.5 mg×7片/盒，南京歐加農(nóng)制藥有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H20051085。

1.2主要試劑及儀器BAO412 bcl-2、BA0315-1 bax、進(jìn)口大鼠原位雜交bcl-2(ISH-5116)、進(jìn)口大鼠原位雜交bax(ISH-5136)均由貴州愛瑞達(dá)生物科技有限公司提供。生物顯微圖像分析儀(5.30-06064)，攝影生物顯微鏡(XSZ-HS3)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9030)，4 ℃冰箱(Sc-Z19A)，電磁爐(RC-200B型)，恒溫干燥箱，電子天平(JA2003N)，臺(tái)式低速離心機(jī)(L600)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法選擇4月齡、體質(zhì)量180～200 g SD雌性大鼠20只作為青年組； 18月齡、體質(zhì)量420～450 g SD雌性大鼠20只作為老年組。選擇11～12月齡、體質(zhì)量280～300 g SD雌性大鼠80只置于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間在同一室內(nèi)籠養(yǎng)，12 h光照、12 h黑暗的條件下，每日更換飲水，給予足夠顆粒飼料，室溫18～22 ℃，以陰道脫落細(xì)胞角化試驗(yàn)驗(yàn)證模型，結(jié)果均觀察到底層細(xì)胞均在50%以上，涂片呈現(xiàn)為動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長(zhǎng)，證明為圍絕經(jīng)期。之后每日常規(guī)消毒后左右交替于模型大鼠臀部肌肉豐厚的部位注射氫化可的松0.5 mL/100 g，連續(xù)肌注9 d，間停4 d。見動(dòng)物出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振、反應(yīng)遲鈍、扎堆、拱背少動(dòng)、毛不光潔、豎毛時(shí)則認(rèn)為腎陽虛型模型造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為自擬更年湯組、教材方組、利維愛組、生理鹽水組，每組20只。各給藥組給藥劑量均按人鼠體質(zhì)量換算，人體質(zhì)量按60kg計(jì)算，人與大鼠的等效劑量比值為1∶6～7，劑量以mg/kg表示。更年湯組、教材方組、利維愛組分別給予更年湯溶液[含生藥量1.8 g/mL,約18 g/(kg·d)]、教材方溶液[含生藥量1.6 g/mL,約16 g/(kg·d)]、利維愛溶液[含藥量0.029 4 mg/mL,約0.294 mg/(kg·d)]各4 mL灌胃，青年組、老年組、生理鹽水組均給予生理鹽水4 mL灌胃，均1次/d，連續(xù)15 d。因動(dòng)物之間的相互撕咬、灌胃時(shí)操作不當(dāng)以及大鼠對(duì)麻醉藥物烏拉坦的耐受較差導(dǎo)致動(dòng)物死亡，至采集標(biāo)本時(shí)，大鼠的數(shù)量青年組13只、老年組13只、生理鹽水組13只、更年湯組16只、教材方組15只、利維愛組14只。末次給藥24 h后，先用20%烏拉坦根據(jù)大鼠體質(zhì)量按0.5 mL/100 g腹腔給藥麻醉，確認(rèn)麻醉生效股動(dòng)脈放血處死，即刻剖腹摘取大鼠雙側(cè)卵巢，運(yùn)用病理切片觀察卵巢組織大體形態(tài)，運(yùn)用免疫組化及原位雜交法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA表達(dá)情況，具體實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格參照試劑盒說明。

1.4免疫組化及原位雜交判定標(biāo)準(zhǔn)[1]在顯微鏡下根據(jù)切片中標(biāo)記蛋白及mRNA染色的深淺分4級(jí)：未被染色的為陰性表達(dá)(-)，淺棕色為弱陽性表達(dá)(+)，棕黃色為中度陽性表達(dá)()，棕褐色為強(qiáng)陽性表達(dá)()。為了統(tǒng)計(jì)方便，將“-、+、、”分別計(jì)為0，1，2，3分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，整體比較用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)，組間等級(jí)資料的兩兩樣本比較用兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠卵巢病理切片表現(xiàn)6組間卵泡發(fā)育良好、卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。老年組與生理鹽水組卵泡發(fā)育良好情況低于青年組(P均<0.05)，卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況重于青年組(P均<0.05)；各給藥組卵泡發(fā)育良好情況優(yōu)于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)，卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況輕于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)；自擬更年湯組與利維愛組卵泡發(fā)育良好情況優(yōu)于教材方組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；自擬更年湯組卵泡閉鎖、卵泡擴(kuò)張情況輕于教材方組和利維愛組(P均<0.05)，教材方組與利維愛組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠卵巢病理切片表現(xiàn)　只

2.2各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax與bax mRNA表達(dá)情況6組間bax、bax mRNA陽性表達(dá)情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。老年組與生理鹽水組bax、bax mRNA陽性表達(dá)高于青年組(P均<0.05)，各給藥組bax、bax mRNA陽性表達(dá)明顯低于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組bax、bax mRNA陽性表達(dá)明顯低于教材方組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax與bax mRNA表達(dá)情況　只

2.3各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bcl-2與bcl-2 mRNA表達(dá)情況6組間bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。老年組與生理鹽水組bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)低于青年組(P均<0.05)，各給藥組bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)明顯高于老年組和生理鹽水組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組bcl-2與bcl-2 mRNA陽性表達(dá)明顯高于教材方組(P均<0.05)，自擬更年湯組與利維愛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

3討論

表3　各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bcl-2與bcl-2 mRNA表達(dá)情況　只

卵巢為女性的性腺，卵泡自胚胎形成后即進(jìn)入自主發(fā)育和閉鎖的軌道，出生時(shí)卵泡約有200萬個(gè)，隨著人體的生長(zhǎng)發(fā)育，卵泡自行凋亡，到青春期約剩下30萬個(gè)。卵泡發(fā)育良好的表現(xiàn)是卵巢內(nèi)卵泡的數(shù)量較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)生變異；卵泡閉鎖的表現(xiàn)是卵泡結(jié)構(gòu)被破壞，體積縮小，卵泡腔縮?。宦雅輸U(kuò)張的表現(xiàn)是卵泡原有的結(jié)構(gòu)破壞，體積增大，卵泡腔擴(kuò)大。女性到51歲時(shí), 卵巢中約剩下1 000個(gè)發(fā)育不良或無功能性的卵泡, 標(biāo)志著絕經(jīng)的來臨[2]。圍絕經(jīng)期的女性，由于功能性卵泡的閉鎖，使生育功能完全喪失，卵巢的內(nèi)分泌功能失常，合成的雌激素減少，從而導(dǎo)致一系列軀體和生理的病理表現(xiàn)。目前很多研究證實(shí)細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)節(jié)，其中最重要的有bcl-2家族、P53等凋亡相關(guān)基因，bcl-2家族可以分為2大組，其中抑制細(xì)胞凋亡的有bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的有bax[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為卵巢顆粒細(xì)胞凋亡受bcl-2、bax基因調(diào)控，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，觸發(fā)卵泡閉鎖，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素減少，促性腺激素受體減少，從而引發(fā)圍絕經(jīng)期綜合征(PMS)[4-5]。生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞中存在bcl-2的優(yōu)勢(shì)表達(dá)。bax的表達(dá)通過線粒體途徑介導(dǎo)，而后誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，繼而激活caspase-3、caspase-9，引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡[6]。

自擬更年湯實(shí)為六味地黃丸、二仙湯、二至丸與獨(dú)活寄生湯加減化裁而成，大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為絕經(jīng)期綜合征病位在腎，腎虛為本。腎為先天之本，主生殖，同時(shí)也是“五臟六腑之本，十二經(jīng)脈之根”，其與女性的月經(jīng)、生殖密切相關(guān)。筆者在臨床中發(fā)現(xiàn)腎陽虛及陰陽俱虛之患者單以補(bǔ)腎溫陽滋陰方法治療效果不太理想，腎陽虛則對(duì)機(jī)體各臟腑組織器官的推動(dòng)、溫煦作用減弱，各臟器的陰陽之間失去平衡。腎氣虛衰，氣血虛弱無力推動(dòng)血液的運(yùn)行、津液的生成輸布和排泄，影響各臟腑功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)阻滯；陽虛失于溫煦，衛(wèi)護(hù)肌表、防御作用減弱，可見衛(wèi)表不固，風(fēng)寒濕邪易于侵犯肌膚；所以筆者認(rèn)為絕經(jīng)前后婦女腎虛與經(jīng)絡(luò)阻滯、外邪犯表同在，腎虛為本，經(jīng)絡(luò)閉阻為標(biāo)，故遵循中醫(yī)標(biāo)本同治的原則，在治療上提出了補(bǔ)腎溫陽、祛風(fēng)散寒的全新治療思想，補(bǔ)腎與祛風(fēng)通絡(luò)雙管齊下，溫補(bǔ)腎陽，溫煦內(nèi)寒，驅(qū)散外寒，能顯著改善絕經(jīng)前后諸證的腎陽虛證或腎陰陽兩虛證的臨床癥狀。但自擬更年湯對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影響尚不明確，故進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)中之所以選擇SD雌性大鼠，因?yàn)閷?duì)豚鼠、小鼠、大鼠和猴研究發(fā)現(xiàn), 只有大鼠和猴出現(xiàn)與生殖功能降低有關(guān)的潮熱癥狀[7-8]，加之大鼠價(jià)格較低、易于獲得、易于飼養(yǎng)，所以大鼠通常作為絕經(jīng)模型首選。目前大鼠圍絕經(jīng)期模型分為卵巢去勢(shì)型、自然衰老型。雌性大鼠從11月齡開始就進(jìn)入更年期, 這與人更年期生物學(xué)特性相仿,且自然衰老的大鼠比較符合人類圍絕經(jīng)期變化過程，同時(shí)可以避免因手術(shù)摘除卵巢造成動(dòng)物死亡，因此本實(shí)驗(yàn)選擇11～12月齡大鼠作為圍絕經(jīng)期模型大鼠。結(jié)果顯示，自擬更年湯能促進(jìn)圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢卵泡的良好發(fā)育，減少卵泡的閉鎖和擴(kuò)張，從而促進(jìn)卵巢部分功能的恢復(fù)；而且自擬更年湯能抑制模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞促凋亡因子bax及bax mRNA的陽性表達(dá)，增加模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞抑制凋亡因子bcl-2及bcl-2 mRNA的陽性表達(dá)。

綜上所述，自擬更年湯能抑制卵泡的閉鎖和擴(kuò)張，促進(jìn)卵泡的良好發(fā)育，能上調(diào)卵巢顆粒細(xì)胞抑制凋亡因子bcl-2、bcl-2 mRNA的陽性表達(dá)，抑制促凋亡因子bax、bax mRNA的陽性表達(dá)，從而能抑制模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，延緩卵巢的衰老。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)細(xì)胞凋亡起主要作用的bcl-2、bax進(jìn)行了研究，不能全面闡述細(xì)胞凋亡多基因間的相互作用，期望在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討有關(guān)引起卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

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Effect of Gennian docoction on ovarian cell apoptosis-related factors in the rats with perimenopause of Kidney-Yang deficiency type

ZHANG Fan1,WU Chuangxin2,QI Shuaiying3,YI Huaya4

(1.The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of TCM, Guiyang 550002, Guizhou, China；2.The People’s Hospital of Huating County, Huating 744000, Ganzu, China; 3.Fushun Hospital of TCM, Fushun 113008, China; 4.Guiyang College of TCM, Guiyang 550002, Guizhou, China)

Abstract:Objective It is to evaluate the effect of Gengnian decoction on ovarian tissue morphology，bax ,bax mRNA,bcl-2,bcl-2 mRNA which is one of apopcosis factor of Kidney-Yang deficiency type perimenopause rat’ ovarian granulosa cells．Methods To build natural aging perimenopause model rats by selecting the exfoliated cervicall cells of female SD rats on 11-14 months age and intramuscular injection altemately hydrocortisone to build the rat model with Kidney-Yang deficiency type perimenopause. Then the models were randomly divided into four groups: Gennian decoction group, textbook group, Livial group and normal saline group.At the same time, the study chose four-month-old female SD rats and eighteen-month-old female SD rats as compared group. The young group, elderly group and normal saline group were treated with normal saline by gavage, every treatment group were treated with respective drug by gavage. After treatment accordingly， by adopting pathological sections to understand morphological changes of rats’ ovarian,adopting Immunohistochemistry and in Situ Hybridization technique to compare the positive expression of ovarian granulose cell bax,bax mRNA,bcl-2,bcl-2 mRNA in every group. Results Each dosage groups compared with normal saline group, the elderly group, follicular development situation were well (P<0.05), follicular atresia, follicle expansion were reduced (P<0.05); The Gengnian decoction and Livial group of follicular situation was superior to the textbooks party group (P<0.05), and the difference between the two groups had no statistical significance (P>0.05). The follicular atresia, follicle expansion in Gengnian decoction group were better than that in Livial group, textbooks group (P<0.05), the textbook group compared with the Livial group had no statistical significance (P>0.05). Each dosage groups compared with normal saline group, the elderly group, bax, bax mRNA positive expression were lower (P<0.05), the bcl-2 and bcl-2 mRNA positive expression had raised (P<0.05); The Gengnian Decoction and Livial group's bax, bax mRNA positive expression were lower than that in group teaching material side (P<0.05), the bcl-2 and bcl-2 mRNA positive expression were significantly higher than textbooks party group (P<0.05), there was no statistically significant difference between Gennian decoction and Livial group(P>0.05).Conclusion Gengnian decoction can promote follicular development, inhibit follicular atresia and expansion, up-regulate the positive expression of bcl-2 and bcl-2 mRNA, down-regulate the positive expression of bax and bax mRNA in ovarian granulosa cells．

Key words:Gengnian decoction; perimenopause; Kidney-Yang deficiency; cell apoptosis factor

[收稿日期]2015-09-25

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)08-0799-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.001

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160491)

[作者簡(jiǎn)介]張帆，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療婦女生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病。[通信作者]齊帥英，E-mail：455729354@qq.com