濕式大腸菌群快檢紙片性能驗(yàn)證的方法探索

劉哲 李丹妮 王宇 王濤 王萌 馮淑

摘 要：目的：探索對(duì)市售濕式大腸菌群快檢紙片性能進(jìn)行分析、驗(yàn)證的一般流程，為檢測(cè)、監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)、企業(yè)和個(gè)人選用、驗(yàn)收該類快檢產(chǎn)品提供參考。方法：從紙片的污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)、檢出水平（LODX）、檢測(cè)結(jié)果有效性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性等方面進(jìn)行試驗(yàn)研究，對(duì)紙片的性能進(jìn)行綜合分析和驗(yàn)證。結(jié)果：紙片的各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果基本符合預(yù)期和產(chǎn)品自身的質(zhì)量要求。結(jié)論：本文所探索的對(duì)濕式大腸菌群快檢紙片性能進(jìn)行分析驗(yàn)證的一般流程可有效對(duì)該類紙片產(chǎn)品進(jìn)行較為全面的性能驗(yàn)證，在使用該類快檢產(chǎn)品時(shí)可作為產(chǎn)品選用和驗(yàn)收、驗(yàn)證的參考。

關(guān)鍵詞：大腸菌群;快檢紙片;性能驗(yàn)證

大腸菌群是指一類在一定培養(yǎng)條件下能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌[1]。濕式大腸菌群快檢紙片是近年來(lái)新出現(xiàn)的可用于餐（飲）具或公共場(chǎng)所用品用具大腸菌群檢測(cè)的快檢產(chǎn)品，該類產(chǎn)品具有攜帶方便、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，且相較于干式快檢紙片省去了使用無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)濕紙片的環(huán)節(jié)，從而降低了檢測(cè)操作和環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)[2]。

近年來(lái)，隨著各類快檢產(chǎn)品出現(xiàn)的越來(lái)越多，各產(chǎn)品的質(zhì)量也參差不齊[3-4]，產(chǎn)品使用單位或個(gè)人對(duì)所購(gòu)買產(chǎn)品的性能缺乏有效了解。本文將著重探索對(duì)濕式大腸菌群快檢紙片的性能進(jìn)行分析、驗(yàn)證的一般流程，為產(chǎn)品使用單位或個(gè)人選用和驗(yàn)收、驗(yàn)證該類大腸菌群快檢產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

環(huán)境樣本（自然環(huán)境、居住、辦公環(huán)境等）、人工污染樣本。濕式大腸菌群快檢紙片、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、無(wú)菌接種環(huán)、無(wú)菌移液管、無(wú)菌平皿等。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）、產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048）、福氏志賀氏菌（CICC 21534）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、糞腸球菌（ATCC 29212）和金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜、冰箱（2～8 ℃）、培養(yǎng)箱（36±1）℃、渦旋振蕩器、移液槍等。

1.3 方法

本文將著重對(duì)紙片的污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)、檢出水平（LODX）、檢測(cè)結(jié)果有效性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性驗(yàn)證等方面進(jìn)行試驗(yàn)分析。

1.3.1 污染指標(biāo)

選取2～4個(gè)不同批號(hào)（本次試驗(yàn)為4個(gè)批號(hào)：200605、200903、210505和210506）的濕式大腸菌群快檢紙片產(chǎn)品，無(wú)菌操作，每個(gè)批號(hào)分別取5張快檢紙片，裝入紙片配套的無(wú)菌小袋中，置（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

1.3.2 特異性指標(biāo)

本文綜合濕式大腸菌群快檢紙片自身的產(chǎn)品質(zhì)量要求和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）中對(duì)大腸菌群相關(guān)培養(yǎng)基、試劑的質(zhì)量要求，確定使用大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌等7種菌對(duì)紙片進(jìn)行大腸菌群的特異性驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)從上述7種菌的新鮮營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上沾取一環(huán)菌，直接于紙片表面劃線，然后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察各菌在紙片上的特異形態(tài)。本文試驗(yàn)中選取了4個(gè)不同批號(hào)（同1.3.1）的紙片進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

1.3.3 檢出水平（LODX）

本文通過(guò)紙片對(duì)高、中、低3個(gè)接種水平和空白的樣本勻液的測(cè)試結(jié)果來(lái)獲得該紙片法的檢出水平（由于測(cè)試的樣品數(shù)量較少，本文中使用“估計(jì)LOD50”[5]），高、中、低3個(gè)接種水平和空白分別做2個(gè)測(cè)試，共獲得8個(gè)結(jié)果。記錄每個(gè)接種水平獲得的陽(yáng)性結(jié)果（檢出）數(shù)量，使用《微生物檢測(cè)方法確認(rèn)與驗(yàn)證指南》（RB/T 033—2020）附錄B中的表B.1確定估計(jì)LOD50。

高水平接種量為不超過(guò)預(yù)期LOD50（預(yù)期的LOD50設(shè)定為：≤3 CFU/測(cè)試單元[5]）的10倍，中水平接種量可由高水平接種物稀釋2倍獲得，低水平接種量可由高水平接種物稀釋10倍獲得。

用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）制備濃度（單位：CFU/mL）分別為高、中、低接種水平10倍的接種物勻液。測(cè)試時(shí)，無(wú)菌操作，先取適量濕式大腸菌群快檢紙片置于配套的無(wú)菌袋中，然后分別吸取0.1 mL（測(cè)試單元）各接種水平的接種物勻液和空白液，均勻滴加（接種）于紙片表面，每個(gè)接種水平和空白分別測(cè)試2張紙片，滴加（接種）完成后，將紙片置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。同時(shí)，分別吸取0.1 mL各水平接種物勻液和空白液加入2個(gè)無(wú)菌平皿，立即倒入15～20 mL冷卻至46 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，搖勻，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，對(duì)各接種水平的接種物勻液濃度和空白對(duì)照進(jìn)行同步確認(rèn)。觀察并記錄測(cè)試結(jié)果。

1.3.4 檢測(cè)結(jié)果有效性

本文試驗(yàn)中，為覆蓋更廣泛的微生物種類，用濕式大腸菌群快檢紙片對(duì)采集的21個(gè)自然環(huán)境（土壤、河流、小溪等）樣本、30個(gè)居住環(huán)境（廚房、餐廳、衛(wèi)生間和臥室等）樣本和20個(gè)辦公環(huán)境（辦公室、走廊、電梯間、公共衛(wèi)生間等）樣本，共計(jì)71個(gè)環(huán)境微生物樣本進(jìn)行檢測(cè)，然后將所有的檢測(cè)結(jié)果用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 消毒餐（飲）具》（GB 14934—2016）中的附錄B B.1發(fā)酵法進(jìn)行確認(rèn)，從而對(duì)紙片的檢測(cè)結(jié)果有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

操作時(shí)，環(huán)境表面的微生物樣本直接用紙片進(jìn)行采集，土壤、河流等不適合直接采集微生物的樣本，加無(wú)菌生理鹽水振蕩提取其中的微生物后，取適量提取液置營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）中培養(yǎng)過(guò)夜，再取樣本培養(yǎng)液劃線接種于紙片，（36±1）℃培養(yǎng)18 h，記錄檢測(cè)結(jié)果。液體樣本直接取適量樣本勻液經(jīng)肉湯增菌后，取增菌液劃線接種于紙片。

無(wú)菌操作，將培養(yǎng)后的紙片全部分別轉(zhuǎn)移至LST肉湯管，置培養(yǎng)箱中（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。后續(xù)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)和結(jié)果判定按GB 14934—2016附錄B B.1發(fā)酵法中的要求進(jìn)行。觀察并記錄測(cè)試結(jié)果。

1.3.5 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性

同一生產(chǎn)批號(hào)的紙片可通過(guò)在常規(guī)條件下保存3～6個(gè)月以上后再次進(jìn)行污染指標(biāo)和特異性指標(biāo)的驗(yàn)證來(lái)分析該紙片在產(chǎn)品有效期內(nèi)的質(zhì)量穩(wěn)定性，本次試驗(yàn)選取已于常規(guī)保存條件下保存11個(gè)月的濕式大腸菌群快檢紙片（生產(chǎn)批號(hào)：200605）進(jìn)行驗(yàn)證。不同生產(chǎn)批號(hào)紙片質(zhì)量的持續(xù)穩(wěn)定性由1.3.1～1.3.3的試驗(yàn)中，同時(shí)或先后選取2～4個(gè)不同批號(hào)的紙片進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 污染指標(biāo)

試驗(yàn)中4個(gè)不同批號(hào)的紙片經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)18 h后，均無(wú)變化，保持初始的狀態(tài)和顏色（濕潤(rùn)、平整，紫色）。表明在無(wú)菌操作及規(guī)定的培養(yǎng)條件下，紙片和配套的無(wú)菌塑料小袋自身不會(huì)出現(xiàn)污染而干擾大腸菌群檢測(cè)。

2.2 特異性指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種大腸菌群（大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）在紙片上生長(zhǎng)旺盛，且呈現(xiàn)典型的陽(yáng)性反應(yīng)，即紙片上可見(jiàn)點(diǎn)、線狀紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈，斑點(diǎn)周圍變黃或明顯變黃。其他4種菌中，鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌呈陰性反應(yīng)，即紙片上可見(jiàn)點(diǎn)、線狀紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈，但斑點(diǎn)或紅暈周圍顏色不變。另外2種革蘭氏陽(yáng)性菌處于被抑制狀態(tài)，只可見(jiàn)少量紅色斑點(diǎn)或紅暈且斑點(diǎn)或紅暈周圍不變色，呈陰性反應(yīng)，且各菌在不同批號(hào)紙片上的特異形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別。說(shuō)明本次試驗(yàn)中該紙片對(duì)大腸菌群和非大腸菌群細(xì)菌可呈現(xiàn)明顯的特異性反應(yīng)，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有一定抑制作用。

2.3 檢出水平（LODX）

檢出水平的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，紙片在樣品（接種物勻液）處于低污染水平時(shí)，即測(cè)試單元（0.1 mL樣液）中的目標(biāo)微生物數(shù)為1CFU（（0+2）/2=1）時(shí)，即有50%的概率檢出該菌（2張測(cè)試紙片中有1張檢出（陽(yáng)性））。在高污染水平和中污染水平時(shí)2張紙片均檢出。且2個(gè)批號(hào)的紙片測(cè)試結(jié)果一致。查RB/T 033—2020附錄B 表B.1，得估計(jì)LOD50（CFU/測(cè)試單元）=1 CFU/測(cè)試單元。測(cè)試結(jié)果間接表明該紙片的性能符合預(yù)期。

2.4 檢測(cè)結(jié)果有效性

樣本的紙片檢測(cè)結(jié)果及發(fā)酵法對(duì)紙片檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在本次試驗(yàn)中，該紙片的檢測(cè)結(jié)果與發(fā)酵法的驗(yàn)證結(jié)果一致，說(shuō)明對(duì)采集到的同一樣本，其與發(fā)酵法的檢測(cè)結(jié)果一致，表明該紙片顯示的檢測(cè)結(jié)果與發(fā)酵法結(jié)果同等可靠有效。

2.5 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性

同一批號(hào)（200605）的紙片在常規(guī)條件下保存11個(gè)月之后，其污染指標(biāo)和特異性指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果未發(fā)生變化。不同批號(hào)的紙片，其污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)和檢出水平的測(cè)試結(jié)果一致（參見(jiàn)2.1～2.3）。

結(jié)果表明該紙片不論是同一批號(hào)產(chǎn)品在有效期內(nèi)的質(zhì)量穩(wěn)定性，還是不同批號(hào)產(chǎn)品質(zhì)量的持續(xù)穩(wěn)定性均符合預(yù)期。

3 結(jié)論

本文對(duì)選取或設(shè)定的濕式大腸菌群快檢紙片的污染指標(biāo)、特異性指標(biāo)、檢出水平（LODX）、檢測(cè)結(jié)果有效性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性等5項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行了較為詳細(xì)的試驗(yàn)分析，證明該紙片性能穩(wěn)定可靠，符合要求和預(yù)期的同時(shí)，也表明本文所探索的對(duì)濕式大腸菌群快檢紙片性能進(jìn)行分析驗(yàn)證的一般流程可有效的對(duì)該類紙片產(chǎn)品進(jìn)行較為全面的性能驗(yàn)證，在使用該類快檢產(chǎn)品時(shí)可作為產(chǎn)品選用和驗(yàn)收、驗(yàn)證的參考。

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