關(guān)山櫻花總黃酮含量測定及其亞硝酸鹽清除作用

李飛陽 姚文紅 孫立梅 張林超

摘要：本試驗(yàn)利用分光光度法測定了關(guān)山櫻花總黃酮含量，研究了關(guān)山櫻花總黃酮對亞硝酸鹽的清除作用。結(jié)果表明：關(guān)山櫻花中總黃酮含量測定的最佳顯色體系為Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系，該方法最佳測定時間為顯色后20～45 min范圍內(nèi)，測定方法精密度RSD=0.49% （n=5 ），加標(biāo)回收率為102.55%（RSD=1.13%），利用該法測得關(guān)山櫻花樣品總黃酮含量為11.25% （RSD=1.44%，n=5）；在體外模擬胃液條件下，關(guān)山櫻花總黃酮濃度在4.00～96.00 μg/mL范圍內(nèi)，對亞硝酸鹽的清除率從14.64%±0.83%增加到99.42%±0.40%，半數(shù)清除率IC50值為18.85 μg/mL，清除效果強(qiáng)于VC。該測定方法簡便準(zhǔn)確，且獲得的關(guān)山櫻花總黃酮對亞硝酸鹽的清除效果顯著。

關(guān)鍵詞：關(guān)山櫻；總黃酮；亞硝酸鹽；清除作用

中圖分類號：S685.99文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0140-05

櫻花是薔薇科Rosaceae 李亞科Prunoidea 櫻屬Cerasus觀賞植物的統(tǒng)稱[1]，原產(chǎn)于北半球溫帶環(huán)喜馬拉雅山地區(qū)，經(jīng)兩千多年研究培育，由本種及其變種與其他種類雜交培育而成的櫻花品種超過300種以上。關(guān)山櫻Cerasus.lannesiana Alborosea俗稱“紅纓”，為日本晚櫻代表品種，植株平均高度2.5 m，小枝多而上彎，嫩葉茶褐色，秋葉橙黃可比銀杏，花期3月底或4月初，數(shù)朵叢生，花色深粉，幽香艷麗，花梗粗長，花莖6 cm左右，花瓣繁復(fù)，約30瓣，2枚雌蕊葉化，不能結(jié)實(shí)，在中國栽植廣泛，北起黑龍江、華北各省，南至海南、云南、廣東、廣西，西到青海、甘肅、新疆均有種植。

櫻花是馳名世界的木本花卉，花開時絢麗燦爛，如云似霞，因此，世界各國科學(xué)家對櫻花的研究主要集中在生物學(xué)特性[2-4]、繁殖技術(shù)[5，6]、病害防治[7]、遺傳多樣性[8]等方面，對其有效成分和藥理作用的研究鮮見報道，雖有學(xué)者對櫻花中揮發(fā)油[9]、多糖[10]及其提取物抗氧化性[11，12]進(jìn)行過研究，但是關(guān)于黃酮類化合物的研究未見報道。本研究以關(guān)山櫻為試驗(yàn)材料，首次對其花中總黃酮含量進(jìn)行測定，進(jìn)一步研究了關(guān)山櫻花總黃酮的亞硝酸鹽清除作用，以期為關(guān)山櫻有效成分的開發(fā)與利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料關(guān)山櫻花采自青島嶗山水峪景區(qū)，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院羅蘭教授鑒定為關(guān)山櫻的花。

1.1.2試劑與儀器試劑：蘆?。暇┑覡柛襻t(yī)藥科技有限公司）；抗壞血酸（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

儀器：UV-1601型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；SP-722型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；AR1140型電子天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；DZX-1型真空干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DF-101B型集熱式磁力加熱攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1顯色體系選擇將關(guān)山櫻花50℃烘干并粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量體積比1∶10加入石油醚浸泡24 h，脫脂干燥后，制得樣品。準(zhǔn)確稱取樣品0.500 0 g以上，按照質(zhì)量體積比1∶50加入50%乙醇25 mL，于70℃恒溫水浴條件下回流提取1 h，趁熱過濾，待其冷卻至室溫，定容至100 mL，制得樣品液。準(zhǔn)確稱取50℃恒溫干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.5 mg，用50%乙醇溶液溶解后定容至250 mL，制得標(biāo)準(zhǔn)液。

原液光譜掃描：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液2.00 mL，樣品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，在200～600 nm波長范圍內(nèi)，進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描。

AlCl3-NaAc顯色體系光譜掃描：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液2.00 mL，樣品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2.00 mL，1.0 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，混合均勻后，靜置25 min，在200～600 nm波長范圍內(nèi)，進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描。

Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系光譜掃描：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL，樣品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，加入0.75 mol/L亞硝酸鈉0.50 mL，混合均勻后，靜置6 min；加入0.25 mol/L硝酸鋁0.50 mL，混合均勻后，靜置6 min；加入1.0 mol/L氫氧化鈉5.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，混合均勻后，靜置25 min，在200～600 nm波長范圍內(nèi)，進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00 mL于25 mL容量瓶，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色反應(yīng)，于510 nm測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)液濃度c對吸光度A的一次線性回歸方程為：A=10.419 69c-0.005 71，R=0.999 69，表明標(biāo)準(zhǔn)品在0.008 1～0.088 9 mg/mL濃度測定范圍內(nèi)，線性關(guān)系很好。

1.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)確移取樣品液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色反應(yīng)，于510 nm每隔2 min測定吸光度，連續(xù)測定120 min，平行3次，以確定最佳測定時間。

1.2.4精密度試驗(yàn)準(zhǔn)確移取樣品液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色反應(yīng)，于510 nm測定吸光度，平行5次，計算RSD。

1.2.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)按表2所示，加入標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色反應(yīng)，于510 nm測定吸光度，計算加標(biāo)回收率。

1.2.6總黃酮含量測定按照1.2.1中樣品液制備方法進(jìn)行試驗(yàn)，平行5次，得到5份關(guān)山櫻花總黃酮提取液；分別準(zhǔn)確移取提取液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度，平行3次；依據(jù)下式計算關(guān)山櫻花樣品總黃酮含量。

總黃酮含量（%）=

（A+0.00571）×25×10010.419 69×1000×2.00×m×100

式中：A為吸光度，m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3亞硝酸鹽清除作用

將關(guān)山櫻花提取液合并后，進(jìn)行旋蒸，除去乙醇，加入適量蒸餾水，配制成總黃酮濃度為1.00 mg/mL的關(guān)山櫻花待測液。準(zhǔn)確移取pH 3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液10.00 mL，分別加入1.00 mg/mL待測液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00 mL，加入100 μg/mL的NaNO2溶液2.00 mL，用蒸餾水分別補(bǔ)至25.00 mL，混合均勻后，保持溫度為37℃，恒溫加熱1 h，讓待測液與亞硝酸鹽充分反應(yīng)。冷卻后，準(zhǔn)確移取反應(yīng)液2.00 mL，分別加入4 mg/mL對氨基苯磺酸4.00 mL，2 mg/mL N-1-萘乙二胺鹽酸鹽4.00 mL，混合均勻后，靜置15 min，以同濃度待測液為參比，于540 nm 測定吸光度[13，14]，重復(fù)3次。

采用上述方法，測定VC溶液亞硝酸鹽清除能力，與待測液進(jìn)行對比。

2結(jié)果與分析

2.1顯色方法選擇

由圖1可知，采用3種顯色體系進(jìn)行試驗(yàn)，樣品液的紫外-可見吸收圖譜具有黃酮類化合物特征吸收峰，但與標(biāo)準(zhǔn)液相比，峰位、峰形均有一定差別，說明樣品液中所含黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品不盡相同。尤其是原液掃描圖譜中，與標(biāo)準(zhǔn)液在240～285、300～450 nm處吸收峰相比，樣品液吸收峰分別發(fā)生藍(lán)移和紅移，合并為一個峰；AlCl3-NaAc顯色體系掃描圖譜中，樣品液在345～500 nm處的吸收峰發(fā)生55 nm紅移、標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液在245～300 nm處的吸收峰，最大吸收波長位置稍有偏差；而Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系掃描圖譜中，標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液吸收峰位置、峰形相似程度很高，特別是450～600 nm處吸收峰，峰形平緩，吸光度與濃度呈線性關(guān)系，而且原液在該處無吸收峰，對含量測定不會產(chǎn)生影響，因此，關(guān)山櫻花總黃酮含量測定最佳顯色體系為Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系，最佳測定波長為510 nm。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

由圖2可以看出，開始階段，顯色絡(luò)合物不夠穩(wěn)定，所測吸光度值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，45 min后所測吸光度值逐漸減小，標(biāo)準(zhǔn)偏差增大，可能是顯色絡(luò)合物部分發(fā)生分解所致，只有20～45 min時間范圍內(nèi)，所測吸光度值RSD=0.026%，明顯小于0～120 min時間范圍內(nèi)測得吸光度值RSD=2.27%。說明，該時間范圍內(nèi)，顯色絡(luò)合物更加穩(wěn)定，因此，關(guān)山櫻花總黃酮含量測定最佳時間為顯色反應(yīng)后20～45 min范圍內(nèi)。

2.3精密度試驗(yàn)

由表1可知，采用該方法測定關(guān)山櫻花總黃酮含量，精密度RSD=0.49% （n=5），該測定方法準(zhǔn)確可行。

2.4加標(biāo)回收率試驗(yàn)

由表2可知，采用該法測定關(guān)山櫻花總黃酮含量，加標(biāo)回收率的示值范圍在100.03%～103.96%之間波動，平均值102.55%，RSD=1.13%，符合定量分析要求。

2.6亞硝酸鹽清除作用

如圖3所示，在保持反應(yīng)溫度為37℃、反應(yīng)液pH值為3、恒溫水浴加熱1 h的條件下，關(guān)山櫻花待測液中總黃酮濃度由4.00 μg/mL遞增至96.00 μg/mL時，亞硝酸鹽清除率由14.64%±0.83%逐漸增加到99.42%±0.40%，總黃酮濃度與亞硝酸鹽清除率基本呈對數(shù)關(guān)系；同濃度VC對亞硝酸鹽的清除率，在16.00～32.00 μg/mL之間從18.57%±1.66%突變?yōu)?8.80%±0.40%，接近VC最大清除率95.22 μg/mL，使得總黃酮濃度在21.15～58.11 μg/mL之間時，關(guān)山櫻花待測液亞硝酸鹽清除率小于同濃度VC，但在其它濃度范圍，關(guān)山櫻花待測液亞硝酸鹽清除率均大于同濃度VC，而且最大清除率明顯高于VC；關(guān)山櫻花待測液IC50值為18.55 μg/mL，小于VC的IC50值20.68 μg/mL。由此可見，關(guān)山櫻花總黃酮亞硝酸鹽清除效果優(yōu)良，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

3討論與結(jié)論

亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉，亞硝酸鈉為白色至淡黃色固體，外觀和滋味與食鹽相似，在工業(yè)、建筑業(yè)中廣為使用，也允許作為發(fā)色劑限量使用于肉類制品中。亞硝酸鹽能使人體血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，從而引起組織缺氧，呼吸中樞麻痹，攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡。食物中大量存在亞硝酸鹽，還是亞硝胺前體物，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署1987年報道：已發(fā)現(xiàn)130多種亞硝胺中，80%以上可致癌，是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界公認(rèn)最強(qiáng)化學(xué)致癌物之一，大量醫(yī)學(xué)研究證明：食道癌、胃癌、肝癌等癌癥發(fā)病率與亞硝鹽攝入量密切相關(guān)[15]。關(guān)山櫻花提取物對亞硝酸鹽有很強(qiáng)的清除能力，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛在價值。

本試驗(yàn)選擇Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色體系，采用分光光度法測定關(guān)山櫻花總黃酮含量，該法操作簡單，線性關(guān)系良好，精密度和回收率均達(dá)到測定要求，該方法測得關(guān)山櫻花樣品總黃酮含量為11.25%，但關(guān)山櫻花經(jīng)過脫脂處理后，樣品質(zhì)量約損失5%，使得所測數(shù)據(jù)偏高。櫻花品種、生長環(huán)境、氣候變化等因素差異，是否會導(dǎo)致所含黃酮類化合物結(jié)構(gòu)、含量產(chǎn)生差異，櫻花有效成分的分離、藥理活性等問題，有待進(jìn)行更加深入的研究。

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