黃曲霉野生型及LaeA缺陷型菌株胞外差異蛋白鑒定

雷陽 呂揚勇 張帥兵 陳菲 呂昂 胡元森

摘要：【目的】分析黃曲霉野生型產(chǎn)毒株及LaeA缺陷型無毒株在以小麥、玉米為培養(yǎng)基質(zhì)中生長時的胞外差異蛋白，為進一步明確LaeA因子在黃曲霉產(chǎn)毒調(diào)控中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。【方法】將小麥及玉米籽粒粉碎后滅菌并加水配制成培養(yǎng)黃曲霉菌的基質(zhì)，在產(chǎn)毒株（黃曲霉CA14野生型）及無毒株（LaeA缺陷型）培養(yǎng)0、48和72 h時取樣，采用SDS-PAGE分別分析黃曲霉毒素B1（AFB1）及胞外差異蛋白，并采用液質(zhì)聯(lián)用四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)[LC-MS-MS（Q-TOF）]對獲得的胞外差異蛋白進行鑒定?！窘Y(jié)果】黃曲霉野生型及LaeA缺陷型菌株均能將小麥和玉米基質(zhì)中的小分子蛋白迅速轉(zhuǎn)化，隨著培養(yǎng)時間延長，LaeA缺陷型菌株的胞外蛋白較野生型菌株略少，不產(chǎn)生黃曲霉毒素。產(chǎn)毒株及無毒株胞外差異蛋白條帶共有7個，主要為淀粉酶A、堿性蛋白酶、木聚糖酶F3和亮氨酸氨基肽酶A等生理酶類?！窘Y(jié)論】黃曲霉產(chǎn)毒株與無毒株的胞外差異蛋白為生理酶類蛋白，該類酶蛋白主要與營養(yǎng)攝入有關(guān)，且影響黃曲霉菌絲的生長。

關(guān)鍵詞： 黃曲霉；胞外蛋白；小麥和玉米；調(diào)控因子LaeA

中圖分類號： S182 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1827-05

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze extracellular differential proteins of Aspergillus flavus wild type and LaeA deficient strains cultured in wheat and corn substrates， in order to provide data for further understanding the roles of regulatory factor LaeA in regulation of aflatoxin production. 【Method】 The wheat and corn grains were grinded， sterilized and made into culture substrate by adding proper amount of water. Samples were taken at 0， 48 and 72 h after being inoculated with toxigenic strains（A. flavus CA14 wild type） and avirulent strains（LaeA deficient type） in substrates. SDS-PAGE was applied to analyze aflatoxin B1（AFB1） and extracellular differential proteins， and LC-MS-MS（Q-TOF） technology was employed to identify the extracellular differential proteins. 【Result】A. flavus wild type and LaeA deficient strains could degrade small molecular proteins in wheat and corn substrates quickly. As time extended， LaeA deficient strains contained fewer extracellular differential proteins than wild type strains and produced no aflatoxin. There were seven extracellular differential protein bands in toxigenic strains and avirulent strains， which were mainly biological enzymes such as alpha-amylase A， alkaline protease， 1，4-beta-xylanase F3 and leucine aminopeptidase A. 【Conclusion】The extracellular differential proteins in A. flavus toxigenic strains and avirulent strains belong to biological enzymes. These enzymes are related to nutrition intake and affect the growth of A. flavus mycelia.

Key words： Aspergillus flavus； extracellular protein； wheat and corn； regulatory factor LaeA

0 引言

【研究意義】黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有極強的毒性，普遍存在于小麥、玉米、花生等大宗農(nóng)產(chǎn)品中（Georgianna et al.， 2010）。據(jù)報道，由于食用被黃曲霉毒素污染的飼料，每年給牧畜業(yè)造成重大損失，黃曲霉毒素引起的食品安全事件也時有發(fā)生（Schmidt-Heydt et al.，2009；計成和趙麗紅，2010）。LaeA是近年來在真菌中發(fā)現(xiàn)的一個主要的全局性調(diào)控因子，其在黃曲霉中的缺失導致AF的生物合成受阻及菌核數(shù)量減少，過量表達則提高aflR的轉(zhuǎn)錄水平，并促進AF和菌核的生成量（Kale et al.， 2008）。目前，關(guān)于LaeA對AF合成調(diào)控的研究主要集中在基因轉(zhuǎn)錄水平，其在蛋白水平的研究鮮有報道。因此，利用黃曲霉野生型產(chǎn)毒株及LaeA缺陷型無毒株為材料，分析兩者在培養(yǎng)基中胞外蛋白差異，對了解LaeA對AF合成的調(diào)控作用，確定黃曲霉菌株生物防治的作用靶點具有重要意義。【前人研究進展】Bok和Keller（2004）、Kale等（2008）分別報道了LaeA的發(fā)現(xiàn)及其對包括AF在內(nèi)多種真菌次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控作用。進一步研究表明，LaeA不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控AFB1的合成，還能通過影響黃曲霉胞外蛋白的分泌種類來調(diào)控毒素合成（Bok and Keller，2004）。Bayram等（2008）指出LaeA與光調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子VeA及VelB形成核復(fù)合物后，依靠VeA的核定位信號進入細胞核，從而調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的生成和表型分化。Kale等（2008）在研究產(chǎn)毒株與LaeA基因缺失株特性時發(fā)現(xiàn)，LaeA基因缺失菌株在花生顆粒表面生長趨勢減弱；進一步揭示LaeA基因缺失影響脂肪酶的分泌，從而影響菌絲生長及AF形成。Amaike和Keller（2009）研究發(fā)現(xiàn)，LaeA基因缺失菌株無法分解種子中的脂類物質(zhì)，其致病性也出現(xiàn)降低。Chang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，LaeA基因缺失后，菌株分生孢子產(chǎn)生量增加而細胞的疏水性降低?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于黃曲霉菌LaeA調(diào)控因子通過對胞外蛋白種類的影響從而調(diào)控黃曲霉毒素合成的研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過液質(zhì)聯(lián)用四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)[LC-MS-MS（Q-TOF）]對黃曲霉野生型產(chǎn)毒株和LaeA缺陷型無毒株在主要糧食作物小麥和玉米中培養(yǎng)時分泌的胞外蛋白進行比較分析，并鑒別由于LaeA因子缺失而影響表達的胞外蛋白種類，為明確LaeA通過影響黃曲霉胞外蛋白調(diào)節(jié)黃曲霉毒素B1（AFB1）的合成機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試菌種：黃曲霉CA14（Aspergillus flavus CA14，產(chǎn)毒株）野生型和LaeA缺陷型（Aspergillus flavus CA14ΔLaeA，無毒株）分別由華南理工大學潘力教授及美國農(nóng)業(yè)部Perng-Kuang Chang教授惠贈。

試劑及儀器：牛血清蛋白（BSA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、黃曲霉毒素B1標準品及考馬斯亮藍G-250均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；微型植物組織粉碎機（FZ102型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；高效液相色譜（Prominence nano 2D，島津Shimazhu），柱子：C18柱，5 μm（美國Eprogen），流速：400 nL/min；質(zhì)譜儀（MicrOTOF-QII，Bruker Daltonics）；分光光度計（UV-

1001，上海美譜達儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 小麥、玉米基質(zhì)制備及接種 稱取小麥和玉米籽粒各25 g，分別用植物組織粉碎機粉碎，高溫滅菌（115 ℃，20 min）后冷卻至室溫；參照蔡靜平等（2012）的方法對粉碎、滅菌的小麥和玉米初始水含量進行測定，并用無菌水調(diào)節(jié)水含量至40%（李軍軍等，2012）。將用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)好的黃曲霉產(chǎn)毒株及無毒株的孢子制成懸浮液，按1.0×107個/g干基分別接種到調(diào)好水含量的小麥和玉米基質(zhì)中，立即混合均勻，平鋪在直徑為16 cm的無菌培養(yǎng)皿中，30 ℃恒溫培養(yǎng)。

1. 2. 2 胞外蛋白的提取、含量測定及電泳分離 胞外蛋白的提取采用乙酸鹽法（梁燕嫦，2009）：取60 mL乙酸鹽緩沖液（50 mmol/L，含2 mmol/L PMSF）浸泡25 g小麥或玉米基質(zhì)培養(yǎng)物10 h，采用0.45 μm濾膜過濾浸提液或12000 g離心去除孢子等固形物，然后用終濃度為10%的三氯乙酸（TCA）進行沉淀，再用丙酮洗滌3次后得到較純的胞外蛋白，對蛋白進行SDS-PAGE電泳和含量測定。蛋白含量測定采用Bradford法，根據(jù)測得的水含量，按照以下公式計算得到干基質(zhì)量的蛋白含量。

蛋白含量（mg/g干基）=[蛋白提取液質(zhì)量濃度（mg/mL）×60 mL]/[25×（1-水含量%）]

利用1×蛋白上樣緩沖液室溫溶解2 h得到蛋白溶液，通過測定蛋白濃度確定蛋白電泳的上樣量為11 μg蛋白/泳道。蛋白電泳采用10%分離膠進行分離。電泳結(jié)束后，使用無菌手術(shù)刀片分別將野生型產(chǎn)毒株及LaeA缺陷型無毒株的差異蛋白條帶切割下來，置于含有超純水的1.5 mL 離心管中，4 ℃保存，送至北京華大基因研究院進行蛋白質(zhì)譜鑒定。

1. 2. 3 蛋白質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析 蛋白質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析由北京華大基因研究院蛋白部提供技術(shù)服務(wù)。流程如下：超純水清洗膠條后加入消化脫色液（50%乙腈，25 mmol/L碳酸氫銨）清洗2次，然后用乙腈脫水至膠粒完全變白，再加入10 mmol/L DTT，56 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束后加入55 mmol/L碘代乙酰胺（IAM），暗室孵育45 min，再加入25 mmol/L碳酸氫銨洗滌2次，將1 μg/μL酶儲液用25 mmol/L碳酸氫銨稀釋15倍后37 ℃水浴消化過夜，加入終濃度為0.1%的FA終止消化，取10 μL進樣進行質(zhì)譜檢測。

液相流動相為A液：100% H2O，B液：100% ACN，二者均含有0.1% FA；流速為400 nL/min。MS/MS掃描范圍為50～2200 m/z；數(shù)據(jù)采集軟件使用Bruker Daltonics micro TOF control；數(shù)據(jù)分析軟件為Data Analysis Software；數(shù)據(jù)搜索引擎為Mascot search engine version 2.3.01，提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，利用Data Analysis標峰后，進行MASCOT搜索，數(shù)據(jù)庫選擇真菌蛋白數(shù)據(jù)庫。

1. 2. 4 黃曲霉毒素定性分析 AFB1提取及含量和定性分析參考文獻（Kale et al.， 2008； Amaike and Keller， 2009）并稍作修改：收集黃曲霉產(chǎn)毒株及無毒株不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)物，加入一定量的無菌水攪拌均勻后加入等體積的氯仿萃取，室溫放置30 min，再用8層紗布過濾除去固形物，取下層有機相進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得固形物溶解于適量氯仿中進行TLC檢測。TLC展開劑為氯仿∶丙酮（95∶5，v/v），使用硅膠板GF254檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃曲霉在小麥、玉米基質(zhì)中生長時胞外蛋白含量變化

分別提取黃曲霉CA14野生型產(chǎn)毒株及LaeA缺陷型無毒株在小麥、玉米基質(zhì)中培養(yǎng)0、48和72 h的胞外總蛋白，并采用Bradford法測定培養(yǎng)過程中的蛋白含量。Bradford法得到的標準曲線如圖1所示，OD595光密度值（y）與蛋白濃度（x）間的方程式為：y=0.78929x-

0.00681， R2=0.99512。據(jù)此推測，OD595光密度值在0.0～0.8 nm，其與蛋白濃度線性關(guān)系較強，擬合度好。按此標準曲線計算胞外蛋白濃度如圖2。圖2顯示，小麥基質(zhì)的初始（0 h）時蛋白含量略高于玉米培養(yǎng)基，可能與小麥籽粒中蛋白含量高于玉米有關(guān)；在兩種培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的延長，黃曲霉無毒株及產(chǎn)毒株在48和72 h時的蛋白含量均較初始（0 h）時有所增加，但與野生型相比，LaeA缺陷菌株胞外蛋白的產(chǎn)生能力稍弱。

2. 2 黃曲霉胞外蛋白分析及黃曲霉毒素測定結(jié)果

分別選取黃曲霉產(chǎn)毒株及無毒株在48和72 h的培養(yǎng)物提取胞外蛋白和AFB1，分別進行SDS-PAGE電泳并定性分析。圖3-a顯示，0 h時即初始小麥培養(yǎng)基中的蛋白含量較高，但蛋白分子量大小不一，電泳結(jié)果未見明顯的條帶，呈彌散狀分布；培養(yǎng)48 h后蛋白含量略有增加，蛋白條帶也明顯增多，說明小麥培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被黃曲霉利用，同時黃曲霉自身向外分泌蛋白；72 h后，胞外蛋白條帶更加清晰，并伴隨有個別條帶消失，暗示黃曲霉分泌蛋白酶降解了部分小麥蛋白，少數(shù)胞外蛋白含量不斷增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h后，黃曲霉在小麥培養(yǎng)基表面產(chǎn)生大量孢子，TLC檢測顯示，野生型菌株在該基質(zhì)中產(chǎn)生了AFB1，而LaeA缺陷型菌株未發(fā)現(xiàn)AFB1（圖3-b）。

從圖3-a中可以看出，小麥培養(yǎng)基中的蛋白在黃曲霉培養(yǎng)過程中被逐漸利用，消除了背景蛋白對黃曲霉胞外差異蛋白鑒定的影響。培養(yǎng)48和72 h時，野生型產(chǎn)毒株有3個蛋白條帶灰度較LaeA缺陷型菌株明顯增強（圖中標示①②③），將該蛋白條帶切割后進行質(zhì)譜鑒定及比對分析。

圖4-a顯示，與小麥中提取得到的蛋白相比（圖3-a，0 h），玉米中的蛋白多為小分子，易被黃曲霉吸收利用（圖4-a，0 h）；隨著培養(yǎng)時間的延長，黃曲霉逐漸積累和分泌胞外蛋白，在48～72 h內(nèi)，胞外蛋白條帶逐漸增多，培養(yǎng)基蛋白不斷減少。TLC分析測定結(jié)果表明，黃曲霉產(chǎn)毒株在48 h時就檢測到AFB1產(chǎn)生，而LaeA缺陷型菌株在72 h內(nèi)還未形成（圖4-b）。

從圖4-a可看出，玉米培養(yǎng)基中的蛋白在培養(yǎng)過程中被黃曲霉利用，對差異蛋白（圖4-a中標示為④⑤⑥⑦）鑒定的影響較小。將標記的差異蛋白條帶切膠后送北京華大基因研究院蛋白部進行鑒定。

2. 3 黃曲霉胞外差異蛋白鑒定

圖3和圖4中標注的7個差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1。經(jīng)鑒定，7個差異蛋白條帶與黃曲霉中5個基因相對應(yīng)。條帶1和條帶6均被鑒定為堿性蛋白酶（Oryzin，分子量42.546 kD）前體，對應(yīng)黃曲霉的基因號為AFL2T_01995；條帶2、條帶4和條帶5經(jīng)鑒定均為淀粉酶A前體，對應(yīng)米曲霉基因組中amyC/amy1（AO090023000944）基因，在黃曲霉中對應(yīng)的基因號為AFL2T_02658，圖4中SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其表達量在以碳水化合物為主要基質(zhì)的玉米培養(yǎng)基中較高；在小麥培養(yǎng)基中，條帶3被鑒定為木聚糖酶F3（1，4-beta-xylanase F3）前體，對應(yīng)黃曲霉中基因編號為AFL2T_07437，與黃曲霉具有利用麩皮中纖維素、半纖維素原料的能力相關(guān)；玉米培養(yǎng)基中，分子量約41.308 kD的條帶7，經(jīng)鑒定為亮氨酸氨基肽酶A前體，在米曲霉中對應(yīng)的基因號為AO090011000052，對應(yīng)黃曲霉中基因號分別為AFL2T_04856和AFL2T_ 12404，其作用主要是將多肽降解為氨基酸及小肽，促進培養(yǎng)基中蛋白的降解。

3 討論

黃曲霉及其次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素在小麥、玉米及花生等大宗農(nóng)產(chǎn)品中廣泛存在，其菌絲在生長過程中分泌的胞外酶對菌絲體生長發(fā)育及毒素的產(chǎn)生具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中的蛋白不斷消耗，黃曲霉產(chǎn)毒株及無毒株胞外蛋白分泌量逐漸增多，說明兩個株型均能合成蛋白酶，將基質(zhì)中的蛋白水解供其自身生長所需。這與其近緣種米曲霉相似，該菌在以大豆為原料進行醬油釀造過程中胞外蛋白酶的表達量較高，與其降解大曲培養(yǎng)基中大豆蛋白的需要有關(guān)（陳紅梅等， 2008；潘力等， 2010；Yoon et al.， 2011）。本研究還發(fā)現(xiàn)，不管以小麥還是以玉米為培養(yǎng)基，LaeA缺陷型無毒株胞外蛋白分泌量總是較同時間段的野生型菌株少，暗示LaeA調(diào)控因子不僅影響黃曲霉毒素合成，還影響菌體胞外蛋白分泌。這與Kale等（2008）的研究結(jié)果相似，即黃曲霉中LaeA因子缺失影響了菌株脂肪酶分泌，從而影響菌絲生長及AF形成。

在SDS-PAGE蛋白圖譜中，條帶1和條帶6為野生型菌株中分泌的表達量較大的蛋白條帶，經(jīng)LC-MS-MS鑒定為蛋白酶前體，暗示野生型菌株較LaeA缺陷菌株合成更多的蛋白酶，對基質(zhì)中的蛋白類營養(yǎng)利用更充分。條帶2、條帶4和條帶5也表現(xiàn)相似的結(jié)果，該條帶經(jīng)鑒定為淀粉酶，也預(yù)示野生型菌株對淀粉原料利用占有優(yōu)勢，保證了菌絲生長所需的能量。該結(jié)果可解釋LaeA缺陷型無毒株菌絲生長較緩慢的原因。

在以小麥和玉米為培養(yǎng)基時，黃曲霉產(chǎn)毒株較無毒株增加的蛋白種類有堿性蛋白酶前體、木聚糖酶F3前體和亮氨酸氨基肽酶A前體。潘力等（2010）在研究米曲霉種曲、大曲的胞外蛋白中也發(fā)現(xiàn)存在木聚糖酶及亮氨酸氨基肽酶A，這些酶類多為誘導酶，是黃曲霉菌以小麥和玉米為培養(yǎng)基質(zhì)中生長時由基質(zhì)中多種復(fù)合多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)誘導產(chǎn)生。綜上所述，黃曲霉菌中LaeA因子缺失對菌絲營養(yǎng)功能影響較大，并繼而影響菌絲生長，但營養(yǎng)功能是否影響其對毒素調(diào)控的作用機制還需進一步研究。

4 結(jié)論

黃曲霉野生型（產(chǎn)毒株）及LaeA缺陷型（無毒株）在小麥、玉米為基質(zhì)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)7個明顯的胞外差異蛋白，經(jīng)鑒定，該蛋白種類包括淀粉酶A前體、堿性蛋白酶前體、木聚糖酶F3前體和亮氨酸氨基肽酶A前體，該類酶蛋白主要與營養(yǎng)攝入有關(guān)，影響黃曲霉菌絲生長。

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（責任編輯 麻小燕）