芒果采后炭疽菌Colletotrichum asianum鑒定及生物學特性研究

孫珊　譚麗玲　龐小婧　吳文嬙　黃東益　黃小龍

摘 要 采用組織塊分離法從采后發(fā)病芒果果肉中分離病原菌，通過形態(tài)學觀察、rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對其進行鑒定，并初步研究其生物學特性。結果表明：從發(fā)病芒果中分離到的病菌T0408鑒定為Colletotrichum asianum Prihastuti， L. Cai & K.D. Hyde。該菌菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃、適宜pH值為5～8；環(huán)境濕度在75%～98%范圍內，濕度越大，菌絲生長速度越快，在3 000 lx日光燈的光照強度下連續(xù)光照有利于菌絲的生長和產孢；孢子萌發(fā)的適宜溫度為25～30 ℃、適宜pH值為6～8，環(huán)境濕度為75%～98%，濕度越大、在3 000 lx日光燈的光照強度下連續(xù)光照有利于孢子的萌發(fā)。

關鍵詞 芒果；采后病害；炭疽病

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹科芒果屬植物，因其營養(yǎng)豐富、口味獨特、外形美觀而被譽為“熱帶水果之王”。原產于亞洲南部熱帶的印度、緬甸、泰國、印度尼西亞、菲律賓一帶，現(xiàn)已廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。中國芒果主要分布在海南、廣西、廣東、云南、四川、福建和臺灣，經(jīng)過多年發(fā)展，芒果產業(yè)已經(jīng)成為中國熱區(qū)重要的農業(yè)支柱產業(yè)之一[1-2]。

芒果采后病害是導致芒果采后損失的主要原因之一，嚴重影響著芒果的貯運質量、貯藏期和貨架期， 造成果實大量腐爛和嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，每年中國的芒果采后損失高達20%～30%，而發(fā)達國家的采后損失也達到15%左右[3]。芒果采后病害有炭疽病、蒂腐病、果腐病、黑腐病、黑星病等，其中炭疽病是導致采后果實腐爛的主要病害之一[4]。引起芒果采后炭疽病的病原菌主要是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[5]，其次是尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）[6]。但Phoulivong等[7]報道了引起泰國芒果采后炭疽病的病原菌為Colletotrichum asianum而非前人所報道的C. gloeosporioides。Honger等[8]也證實從感病的芒果果實、葉片和花序上分離到60株病原真菌，其中來自加納的16株和來自墨西哥的5株鑒定為C. asianum。最近筆者從海南椰香芒（Dashehari）采后病斑的病健交界處分離到一株炭疽菌（編號T0408），該菌致病性較強，具有進一步研究的價值。本研究采用形態(tài)學特征、rDNA-ITS 序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法對其進行種類鑒定，并對該菌生物學特性進行研究，以期為芒果采后炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于病原菌分離的發(fā)病芒果購自海南大學水果街，用于致病性測定和回接炭疽菌的健康芒果購自海南大學附近的南國超市，品種均為椰香芒。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 參照何秀娟[9]的方法并稍加改進，將發(fā)病果實先用自來水清洗，再用去離子水沖洗干凈，在病健交界處切取長5 mm×5 mm的正方形組織塊，在0.1%升汞中浸泡30 s，立即取出，然后用無菌水清洗3次，再刮取黏在果皮內部的黑色發(fā)病組織，放在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，在組織塊周圍長出的菌落邊緣挑取菌絲在PDA平板上點接培養(yǎng)，進一步采用單胞分離的方法純化得培養(yǎng)物。

1.2.2 病原菌的致病性測定 參照何秀娟[9]的方法并稍加改進，取健康無病的椰香芒，用自來水洗凈果皮并用75%酒精浸泡2 min，然后無菌水清洗3次，用脫脂棉吸干表面水分后，采用刺傷接種法，每個果實刺傷2個點，將培養(yǎng)8 d的菌絲塊（Φ=5 mm）接種于刺傷點上，3個重復，以接種無菌PDA培養(yǎng)基為對照，置于保鮮盒中保濕（保鮮盒中放入2張無菌濾紙，并加入少量無菌水），于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待其發(fā)病，并對發(fā)病組織的病原菌按組織分離方法分離，接種后分離獲得菌株與原分離菌株形態(tài)一致的則鑒定為病原菌。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定 （1）病原菌的培養(yǎng)性狀觀察 參照朱桂寧等[10]的方法進行，將分離到的菌株T0408移接于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7～8 d，觀察菌落形態(tài)和顏色，并挑取少量分生孢子于顯微鏡下觀察，檢測分生孢子的形狀、大小及數(shù)量。

（2）病原菌的附著胞誘發(fā)培養(yǎng)及觀察 參照朱桂寧等[10]的方法，在干凈的凹玻片上分別滴1滴無菌水和1滴1%葡萄糖溶液，將菌株T0408的分生孢子分別挑入無菌水和葡萄糖溶液中，再將凹玻片放入有濕潤的無菌濾紙片的培養(yǎng)皿內，28 ℃下保濕培養(yǎng)15～24 h，觀察分生孢子的萌發(fā)情況及附著胞的形態(tài)特征。

1.2.4 病原菌分子鑒定 菌株T0408基因組DNA提取及rDNA-ITS擴增參照陳吉良等[11]的方法，PCR擴增引物為ITS-1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，ITS序列測序后，利用NCBI中BLAST在線比對服務進行同源性比較分析，并以Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 病原菌生物學特性研究 （1）不同溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響：將菌株T0408在PDA平板上培養(yǎng)7 d，沿菌絲生長前沿（呈同心圓狀），用直徑5 mm打孔器制成小菌碟，分別移接1枚于PDA平板中央。分別置于10、15、20、25、30、35和40 ℃的溫度下倒置恒溫培養(yǎng)7 d，設3次重復。逐日定時定點按十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲日均生長速度。

取濃度為1×105個/mL分生孢子懸浮液20 μL， 滴于干燥潔凈凹型玻片上，蓋上蓋玻片，分別放置在10、15、20、25、30、35和40 ℃溫度下恒溫培養(yǎng)10 h，鏡檢分生孢子萌發(fā)率，計數(shù)孢子數(shù)量，設3次重復。當芽管長度大于或等于孢子長度的一半時認定為萌發(fā)。

（2）不同濕度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響：利用飽和鹽或硫酸在25 ℃下對濕度的影響，分別在密閉的玻璃容器中設置98%、93%、90%、85%、80%、75%的相對濕度（RH）。接種方法同（1），將接種好的PDA平板敞口放置于調節(jié)好相對濕度的玻璃容器內，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每一濕度設3次重復，計算菌絲日均生長速度。

取濃度為1×105個/mL分生孢子懸浮液20 μL，滴于干燥潔凈玻片上，在超凈工作臺上迅速風干，分別置RH為98%、93%、90%、85%、80%、75%的密閉玻璃容器中，置25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 h，鏡檢分生孢子萌發(fā)率。

（3）不同pH對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響：在PDA培養(yǎng)基凝固之前，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH分別調節(jié)pH值為4，5，6，7，8和9，倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成pH值分別為4，5，6，7，8和9的PDA平板，接種方法同（1），28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，計算菌絲日均生長速度。

將濃度為1×105個/mL分生孢子懸浮液，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH分別調節(jié)pH值為4，5，6，7，8和9，接種方法同（1），25 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，鏡檢分生孢子萌發(fā)率。

（4）不同光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響：參照劉愛媛等[12]的方法。在PDA平板上移入直徑5 mm的小菌碟，分別置于連續(xù)光照（3 000 lx日光燈）、12 h光暗交替、完全黑暗3種光照條件下25 ℃培養(yǎng)7 d后測量菌落半徑和產孢量，3次重復。

將滴有20 μL（濃度為1×105個/mL）分生孢子懸浮液的載玻片置于上述3種光照處理下，25 ℃保濕培養(yǎng)10 h后鏡檢萌發(fā)率。3次重復。

2 結果與分析

2.1 病原菌T0408的分離及形態(tài)鑒定

在發(fā)病芒果果實（圖1）病斑處，采用組織分離法分離到芒果炭疽病病原菌菌株T0408。該菌在PDA平板上生長，菌落圓形，邊緣整齊，初為白色，后從中央到邊緣逐漸轉為灰白色，具有同心輪紋，菌絲絨毛狀，7 d左右中央菌絲上出現(xiàn)褐色或橘色分生孢子堆（圖2）。分生孢子單胞，棍棒形，兩端鈍圓，無色透明，大小為（11.0～21.0）μm×（2.0～4.0）μm（圖3）；在無菌水中培養(yǎng)的分生孢子未萌發(fā)產生附著胞，在1%葡萄糖溶液中培養(yǎng)的分生孢子萌發(fā)，部分產生附著胞，附著胞近圓形或不規(guī)則形，淺褐色或深褐色（圖3）。上述形態(tài)鑒定結果與James等[13]和Prihastuti等[14]對分離自芒果和咖啡豆的C. asianum描述相似，故將菌株T0408初步鑒定為Colletotrichum屬的病菌。

2.2 病原菌的致病性測定

將菌株T0408接種到健康芒果果實上，開始接口發(fā)黑，后有白色菌絲長出，4 d后產生明顯癥狀，病斑黑色、圓形或近圓形，病健交界明顯（圖4-B）。7 d后病斑擴大至直徑2.3～2.7cm，病斑表面產生大量黑色小顆粒，為分生孢子器（圖4-C）。后期果肉液化、流汁，白色菌絲布滿果實，最后全果腐爛（圖4-D）。表明菌株T0408對芒果具有較強的致病性。

2.3 病原菌rDNA-ITS測序與分析

測序獲得菌株T0408的ITS序列長度為536 bp（登錄號：KX710103），將該序列在NCBI上進行BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，該菌株ITS序列與GenBank已提交的C. asianum序列（登錄號：JX010192；KU498256；KC702983；KC820803）相似性為99%～100%，將菌株T0408的ITS序列與GenBank中的同屬真菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）結果顯示，分離所得菌株T0408與C. asianum歸為同一類群，且種群間具有明顯地區(qū)別，上述結果與病原菌的形態(tài)鑒定結果一致，由此可以進一步確定本研究中引起芒果炭疽病的病原菌為C. asianum。

2.4 病原菌生物學特性研究

2.4.1 溫度對菌落生長及孢子萌發(fā)的影響 在10～40 ℃，該菌菌落均能生長，但生長速度不同，20～30 ℃適合該菌生長，35 ℃時，該菌菌落生長速度下降明顯（表1），40 ℃時菌落不生長。在10～40 ℃，該菌的孢子均能萌發(fā)，但萌發(fā)率有所不同，其中25～30 ℃適合孢子萌發(fā)，30 ℃孢子萌發(fā)率最高，10 ℃孢子萌發(fā)率最低（表1）。

2.4.2 濕度對菌落生長及孢子萌發(fā)的影響 當環(huán)境相對濕度（RH）控制在75%～98%時，該菌均能生長，但培養(yǎng)7 d后該菌的菌落直徑不同，日均生長速度也不同，該菌的孢子在此相對濕度范圍之內也可以萌發(fā)。其中，隨著相對濕度增加，菌落的日均生長速度、孢子的萌發(fā)率均增長，當相對濕度達到98%時，兩者均達到最大值（表2）。

2.4.3 pH對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 在pH值4～9時，該菌均能生長，但是不同pH值的培養(yǎng)環(huán)境下，培養(yǎng)7 d后該菌的菌落直徑不同，菌絲日均生長速度也不同，pH值為5～7時適合菌絲生長，其中pH值為6時，菌絲生長速度最快。在實驗所設置的pH值范圍內，該菌的孢子也均可萌發(fā)，但是孢子萌發(fā)率有所不同，pH值為5～8時適合孢子萌發(fā)，其中pH值為7時，孢子萌發(fā)率最高（表3）。

2.4.4 光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響 在3種光照條件下，該菌均能生長、產孢，孢子也均可萌發(fā)，但是不同光照條件下培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)該菌的菌落直徑不同。在連續(xù)光照的條件下，該菌生長最快、產孢量最多，孢子的萌發(fā)率也最高；在12 h光暗交替的條件下該菌生長良好，但此處理下產孢量和孢子萌發(fā)率均顯著低于連續(xù)光照處理下的產孢量和孢子萌發(fā)率。完全黑暗處理不利于該菌生長、產孢以及孢子萌發(fā)（表4）。

3 討論與結論

炭疽病菌（Colletotrichum asianum Prihastuti， L. Cai & K.D. Hyde）是Prihastuti等[14]從泰國的咖啡豆中分離得到，并進行了新種鑒定。隨后Phoulivong等[7]從泰國感病的芒果、紅辣椒果實中也分離到該菌種。此后，在加納、澳大利亞、哥倫比亞、日本、巴拿馬和菲律賓等國家的芒果上都發(fā)現(xiàn)了C. asianum， 并對當?shù)氐拿⒐麑嵲斐闪艘欢ǖ奈：8，15]。但國內至今尚未見報道，本研究從海南發(fā)病香芒中分離到的炭疽菌T0408，通過形態(tài)與ITS序列分析將其確定為C. asianum。盡管該菌在國外已有報道，但均未對其生物學特性進行過研究。鑒于此，開展炭疽菌T0408（C. asianum）生物學特性研究對指導該病的防治更加必要和有意義。本研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌株T0408菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，40 ℃仍能生長；分生孢子在10～40 ℃范圍內均能萌發(fā)，孢子萌發(fā)的適宜溫度為25～30 ℃；菌絲適宜生長的pH值為5～8，孢子適宜萌發(fā)的pH值為5～8。與黃思良等[16]報道的芒果炭疽病菌C. gloeosporioides的生物學特性比較，炭疽菌株T0408在菌絲生長、孢子萌發(fā)的適宜溫度和pH等方面與C. gloeosporioides相似，但炭疽菌株T0408相對更耐熱些。此外，炭疽菌株T0408在相對濕度越大的環(huán)境下，菌絲生長和孢子萌發(fā)速度越快，這與C.gloeosporioides的特性也基本一致。而連續(xù)光照有利于炭疽菌株T0408菌絲的生長和產孢，這與炭疽病菌C. gloeosporioides存在差異。本研究結果可為炭疽病菌C. asianum病情的預測預報提供一定的參考，從而達到預防該病害發(fā)生的目的。而有關該菌的營養(yǎng)特性、致死溫度（耐熱性）以及常用藥劑的敏感性等還有待進一步探討。

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