雞白細胞介素18基因的克隆與原核表達

宋佰芬　李曉婷　崔玉東

摘 要：白介素18（IL-18）最早被稱為干擾素誘導因子（interferon-γ-inducing factor，IGIF），是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的免疫調節(jié)因子。該實驗根據GenBank中已公布的雞IL-18的基因序列，設計并合成了一對特異性引物，應用RT-PCR方法擴增出IL-18基因，并將該基因克隆到pMD18-T載體中，經過質粒酶切、PCR和測序鑒定，陽性克隆命名為ChpMD18-T-IL-18。將ChpMD18-T-IL-18雙酶切后與pET32a表達載體連接，轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導表達雞IL-18蛋白，結果表明，在28kD左右出現(xiàn)了目的條帶，經western blot檢測確定該蛋白獲得高效表達，為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎。

關鍵詞：雞；白細胞介素18；原核表達

中圖分類號 Q786 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）17-0019-03

Abstract：Interleukin 18（IL-18）is called interferon gamma inducing factor（IGIF）.It is a kind of important immune adjustment factor.In this paper，a pair of specific primer was designed and synthesised according to IL-18 DNA sequence in GenBank，IL-18 gene was amplified by RT-PCR method and was inserted into pMD18-T vector.Positive plasmids were identified by PCR and restriction enzyme digestion methods.Then IL-18 gene was inserted into pET32a vector.Positive plasmids were identified by PCR and restriction enzyme digestion methods and were transformed into escherichia coli competent cells.Recombinant E.coli were induced by IPTG and IL-18 protein was detected by SDS-PAGE and Western blot methods.The results showed IL-18 protein was expressed.This would establish a basis for studying the function of this protein.

Key words：Chicken；Interleukin 18；Prokaryotic expression

白介素18（Interleukin-18，IL-18）又名IFN-γ誘導因子（Interferon-γ Inducing Factor，IGIF），是由激活的單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞產生的一種多功能細胞因子[1]。IL-18具有多種生物學功能[2-4]，能夠誘導NK、NKT、Th1細胞產生IFN-γ、lL-2、TNF-α和GM-CSF等細胞因子，增強CTL細胞和NK細胞的活性，促進T細胞的增殖，增強Th1型細胞的免疫，在抗腫瘤、抗感染等方面具有廣闊的臨床應用前景[5-7]。

唐夢君等將傳染性支氣管炎病毒的M基因與禽源的白介素18基因共同表達，結果表明二者相互作用可以增強雞體對DNA疫苗的免疫應答，提高對IBV強毒的抵抗力[8]。何靜等將IFN-α和雞白介素18進行了融合表達，結果顯示IL-18增強了IFN-α抗病毒活性[9]。以上研究顯示了IL-18的免疫增強效果。但作為IFN-γ的誘生劑，在IFN-γ抗病毒和免疫調節(jié)的過程中它是否也能起到同樣的增強效果，則未見相關的報道。為此，本研究將對該基因進行了原核表達，以期為其功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 E.coil.DH5α和BL21菌株由黑龍江八一農墾大學細胞生物學實驗室保存?？寺≥d體pMD18-T購自寶生物工程大連有限公司。表達載體是pET32a由黑龍江八一農墾大學細胞生物學實驗室保存。

1.2 工具酶和試劑 Rocket ScriptTMRT PreMix反轉錄試劑盒、RNA抽提Trizol試劑盒、RPMI RPMI1640培養(yǎng)液、Hanks液等購自Gibco公司，限制性內切酶Fast Digest BamHI、Fast Digest HindⅢ、T4DNA連接酶、dNTP、DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）購自Transgen公司。LPS購自上海生物工程技術服務有限公司。

1.3 引物設計 根據GenBank登陸的ChIL-18

（gb|AY775780.1|）基因序列設計上游和下游引物F1、R1，上游引入酶切位點BamHⅠ，下游引入酶切位點HindⅢ。

1.4 雞脾淋巴細胞的制備 無菌分離30日齡雞新鮮脾臟，置于盛有Hank's液（含有10%的牛血清和5%的雙抗）的平皿中。用無菌注射器芯將脾臟擠壓通過尼龍膜，300g離心10min洗滌兩次，再以RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌一次，用來去除紅細胞的影響。用倍比稀釋技術稀釋成5×107個·mL-1，24孔板培養(yǎng)。

1.5 雞IL-18的誘導及RNA的提取 將上述雞脾淋巴細胞培養(yǎng)12h后，加入濃度為10μg·mL-1的LPS刺激10h[9]。收獲細胞后。進行總RNA提取，提取方法參照反轉錄試劑盒說明書進行。

1.6 雞IL-18基因的克隆與測序 將上述獲得的cDNA進行PCR擴增，PCR的反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，53℃退火40s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產物經純化后與pMD18-T載體連接過夜，連接產物轉化到E.coil DH5α的感受態(tài)細胞中。并涂布于含有氨芐的抗性平板上，過夜培養(yǎng)。挑單菌落接種到含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃，180r轉震蕩培養(yǎng)過夜。提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定。

1.7 雞IL-18原核表達載體的構建以及重組蛋白的表達 將測序正確的ChpMD18T-IL18進行雙酶切，并與同樣雙酶切的pET32a載體進行連接，轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后，涂布汗氨芐的抗性平板進行篩選。陽性菌落再進一步提取質粒進行雙酶切和PCR鑒定。陽性質粒命名為pET32a-IL18。陽性菌液用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE及Western blot進行檢測[10]。

2 結果與分析

2.1 雞IL-18基因RT-PCR結果 雞脾細胞用LPS誘導后，提取總RNA，反轉錄后進行RT-PCR，并進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果顯示在597bp左右處出現(xiàn)了一目的條帶，與預期相符，結果如圖1。

2.2 雞IL-18克隆載體的鑒定結果 雞IL-18PCR產物純化后，連接到pMD18-T載體中，轉化大腸桿菌后提取質粒進行酶切鑒定，結果切出597bp目的條帶和2 980bp載體條帶，與預計相符，結果見圖2。

2.3 雞IL-18原核表達載體的鑒定結果 將雞IL-18基因連接到原核表達載體pET32a中，并轉化到大腸桿菌中，提取質粒后進行酶切鑒定，結果切出載體和目的兩條條帶，與預期相符，結果見圖3。

2.4 雞IL-18基因表達結果 構建好的重組菌經IPTG誘導表達后，進行SDS-PAGE分析，結果在28kD處出現(xiàn)目的條帶，大小與預計相符，結果見圖4。

2.5 雞IL-18 Western blot結果 將SDS-PAGE電泳凝膠轉移到硝酸纖維素膜上，經抗His-tag一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG二抗反應，最后以DAB顯色，結果在28kD處檢測到表達的蛋白質條帶，結果見圖5。

3 討論與結論

IL-18能誘導機體產生干擾素-γ等細胞因子，而且還具有佐劑的作用，能顯著增強其他疫苗的免疫效果，而干擾素-γ具有廣譜的抗病毒效果。Kim等[11]構建了pOVA/IL18、pOVA、pIL18真核表達質粒，將以上質粒分別或共同肌注免疫小鼠后，檢測pOVA特異性IgG2a和IFN-γ的分泌，結果發(fā)現(xiàn)pOVA/IL18組免疫效果較pOVA組顯著升高，表明IL-18能增強Th1型免疫應答。Mar shall等[12]將PSADNA疫苗與IL-18質粒共同注射小鼠后，發(fā)現(xiàn)IL-18能顯著提高CD4+、CD8+ T淋巴細胞應答和抗原特異性免疫應答及疫苗效能。Billaut等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IL-18DNA質粒與表達HIV-1 Gag，Tat和Nef蛋白的多價DNA疫苗共免疫，可縮短CTL誘導時間2周，增加抗原誘導的IL-2和IFN-γ的分泌，增強抗原特異性Th細胞的增殖，而降低抗HIV抗體滴度。

本研究將IL-18連接到pET32a表達載體中進行誘導表達，結果在28kD處出現(xiàn)目的條帶，經活性分析該蛋白具有生物活性，這為進一步研究該蛋白和IFN-γ共同抗病毒機制的研究奠定了一定的基礎。

參考文獻

[1]Okamura H，Tsutsui H，Kashiwamura S，et al.Interleukin-18：a novel cytokine that augments both innate and acquired immunity[J].Adv Immunol，1998，70：281–312.

[2]Srivastava S，Salim N，Robertson MJ.Interleukin-18：biology and role in the immunotherapy of cancer.Curr Med Chem，2010，17：3353–3357.

[3]Tschoeke SK，Oberholzer A，Moldawer LL.Interleukin-18：a novel prognostic cytokine in bacteria-induced sepsis[J].Crit Care Med，2006，34：1225–1233.

[4]Lee HR，Yoon SY，Song SB，et al.Interleukin-18-mediated interferon-gamma secretion is regulated by thymosin beta 4 in human NK cells[J].Immunobiology，2011，216：1155-1162.

[5]Tse BW，Russell PJ，Lochner M，et al.IL-18 inhibits growth of murine orthotopic prostate carcinomas via both adaptive and innate immune mechanisms[J].PloS One，2011，6：24241.

[6]Tian H，Shi G，Yang G，et al.Cellular immunotherapy using irradiated lung cancer cell vaccine co-expressing GM-CSF and IL-18 can induce significant antitumor effects[J].BMC Cancer，2014，14：48.

[7]Wong JL，Muthuswamy R，Bartlett DL，et al.IL-18-based combinatorial adjuvants promote the intranodal production of CCL19 by NK cells and dendritic cells of cancer patients[J].Oncoimmunology，2013，2：26245.

[8]唐夢君，王紅寧，周生，等.IBV M基因與IL-18基因共表達DNA疫苗的免疫原性[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（7）：757-761.

[9]何靜，張盼盼，孫敏華，等.雞ɑ干擾素/白細胞介素18基因融合表達和抗病毒活性研究[J].華南農業(yè)大學學報，2015，36（1）：18-22.

[10]趙文博，李瑞航，賀鵬亮，等.羊口瘡病毒B2L基因克隆及表達[J].黑龍江八一農墾大學學報，2015，27（2）：42-45.

[11]Kim S H，Cho D，Hwang S Y，et al.Eff icie nt induction of antigen specific T helper type 1-mediated immune re sponses by intramuscular injection with ovalbumin/ interleukin-18 fusion DNA[J].Vaccine，2001，19：4107-4114.

[12]Marshall DJ，Rudnick KA，McCarthy SG，et al.Interleukin-18 enhances Th1 immunity and tumor protection of a DNA vaccine[J].Vaccine，2006，24：244-253.

[13]Billaut-Mulot O，Idziorek T，Loyens M，et al.Modulation of cellular and humoral immune responses to amultiepitopic HIV-1 DNA vaccine by interleukin-18 DNA immunization/viral protein boost[J].Vaccine，2001，19：2803-2811. （責編：張宏民）