高溫大曲中高產(chǎn)α—淀粉酶菌株分離鑒定及其產(chǎn)酶性能研究

魯珍　魏姜勉　諶馥佳

摘 要：以前期實驗從高溫大曲中篩選得到的8株產(chǎn)醬香的細菌為研究對象，利用α-淀粉酶透明圈和α-淀粉酶活性測定相結合的方法從中篩選出1株高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株GX05。 通過形態(tài)觀察及生理生化試驗和16S rDNA 分子生物學鑒定為假蕈狀芽孢桿菌屬（Bacillus pseudomycoides），并對該菌株產(chǎn)酶條件進行研究，最適條件為外加碳源為葡萄糖，氮源為尿素，初始pH 6， 接種量13 % ，培養(yǎng)時間72 h，酶活可以達到180.12 U/g。

關鍵詞：醬香菌株 α-淀粉酶 分離鑒定 酶活

醬香型大曲酒生產(chǎn)歷史悠久、源遠流長，是我國傳統(tǒng)白酒三大基本香型之一，以其醬香突出、幽雅細膩、豐滿味長、空杯留香持久為消費者所喜愛。高溫大曲是產(chǎn)醬香微生物的重要來源，在發(fā)酵和貯存時微生物會分泌多種酶，這些酶不僅對原料的利用有重要作用，對于白酒風味的形成也有重要貢獻[1-2]，而且積累的酶和發(fā)酵的前體物質，對白酒有重要的增香作用[3-4]。

α-淀粉酶是釀酒大曲中的重要指標，也是大部分酒廠衡量大曲質量的指標。醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中，耐高溫 α-淀粉酶能在55 ℃甚至更高溫度下繼續(xù)分解糧食中的淀粉，提高糧食利用率。而在液態(tài)白酒生產(chǎn)過程中加入耐高溫 α-淀粉酶，采用“中溫蒸煮”法，有利于濃醪發(fā)酵并穩(wěn)定出酒率，提高基酒的質量[5]。目前我國的白酒行業(yè)存在的問題是糧耗高，以及糧食利用率不高等問題，因此提高白酒原料利用率和產(chǎn)品質量將是今后白酒行業(yè)發(fā)展的重要方向。研究以前期從高溫大曲中篩選得到的8株產(chǎn)醬香的細菌為研究對象，利用透明圈初篩和固體發(fā)酵復篩從中篩選出高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，以期提高基酒的質量和白酒原料利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

醬香型高溫大曲：由河南省駐馬店市某酒廠提供。

培養(yǎng)基：淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基（牛肉膏 0.5 %，蛋白胨1 %，氯化鈉 0.5 %，可溶性淀粉 2 %，瓊脂粉 2 %，121 ℃，滅菌 20 min）；種子液培養(yǎng)基（牛肉膏 0.5 %，NaCl 0.5 %，可溶性淀粉 0.5 %，蛋白胨 1 %，調pH 7.0）；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（麩皮 10 g，K2HPO4 0.02 g，MgSO4 0.02 g，KNO3 0.3 g，水 6 mL）；斜面保藏培養(yǎng)基（牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，水1 L，pH7.0，1×105 Pa ，滅菌20 min）。其他試劑均為分析純試劑。

儀器： LDKM-40KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-250FE智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司；ZWY-240恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈操作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；JB5374-91電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司； PHS-3C精密pH計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 α-淀粉酶透明圈初篩和酶活復篩

將初期已篩選得到的8株產(chǎn)醬香細菌分別接種到種子液培養(yǎng)基上進行活化，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，然后分別稀釋涂布于淀粉瓊脂篩選培養(yǎng)基上，置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，挑出各菌株的單菌落平板，用盧氏碘液噴灑染色至碘液將平板覆蓋均勻，靜置 1 min，產(chǎn)生透明圈的菌株初步定為淀粉酶產(chǎn)生菌株。最后挑選出產(chǎn)生透明圈的菌株，測定菌落直徑（D1）和透明圈的直徑（D2），并計算其 HC 值（D2/D1）。根據(jù)各菌種透明圈的大小，初步評價各菌株產(chǎn)淀粉酶的能力[6]。

將初篩菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min，搖床培養(yǎng) 12 h。按照5 %的接種量將種子液接到三角瓶固料培養(yǎng)基中，50 ℃培養(yǎng) 48 h。稱取 3.0 g 固體發(fā)酵物，置于100 mL 容量瓶中，用水定容，混勻后在室溫（30 ℃）下放置 20 min，每隔 3 min 振蕩1次，最后用濾紙過濾，取濾液測其淀粉酶活性[7-8]。

固體發(fā)酵α-淀粉酶酶活力測定：采用3，5-二硝基水楊酸顯色法[9]。麥芽糖標準曲線見圖1。

1.2.2 高產(chǎn)α-淀粉酶菌株鑒定

菌落形態(tài)觀察及生理生化鑒定，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[10]。另外對該菌株進行分子生物學鑒定，菌體總DNA的提取[11]：菌株基因組用Sigmen Bacteria DNA Kit 提取，具體操作步驟按照試劑盒附帶的說明書進行。16S rDNA 測序由南京金瑞斯生物工程有限公司完成。將測序結果與NCBI中的BLAST結果對比，用Neighbor-Joining[12]構建目標菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 高產(chǎn)α-淀粉酶菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件研究

通過單因素試驗，分別研究不同氮源（尿素，硫酸銨，硝酸銨，黃豆，蛋白胨）、不同碳源（高粱，麩皮，可溶性淀粉，葡萄糖）、初始pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、不同接種量（3 %，5 %，7 %，9 %，11 %，13 %，15 %），不同發(fā)酵時間（24、36、48、60、72、84、96 h）對產(chǎn)酶的影響，將目標菌株活化后，按5 %的接種量接入250 mL三角瓶基礎發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)到最優(yōu)產(chǎn)酶時間后，測定發(fā)酵液的淀粉酶活性，再進一步通過正交試驗法確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。

2 結果與分析

2.1 高產(chǎn)α-淀粉酶酶活菌株的篩選

前期已從高溫大曲中篩選得到8株產(chǎn)醬香的細菌，對8種菌透明圈的大小進行了比較，其中GX05的比值較大，為1.49。雖然透明圈的大小直接反映了酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，因此又通過固態(tài)發(fā)酵復篩測定酶活，GX05菌株酶活最高，固態(tài)發(fā)酵酶活為66.55 U/g，與初篩結果一致見表1。

2.2 菌種鑒定結果

從形態(tài)觀察看該菌菌落大小適中，中央有突起，圓形，規(guī)則，顏色呈灰白色，不透明。顯微鏡觀察菌體特征是桿狀，革蘭氏陽性菌，其部分生理生化特征見表2。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對芽孢桿菌的描述，初步確定GX05為芽孢桿菌類。

16S rDNA序列是細菌鑒定的重要指標，已成為現(xiàn)代細菌分類的重要手段。本研究通過擴增菌株GX05的16S rDNA序列，得擴增結果；將該片段用NCBI的Blast軟件進行核苷酸同源性比對，得出其分類地位的系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，菌株擴增結果見圖3。該菌株與Bacillus pseudomycoides DSM 12442T相似度為99 %，綜合形態(tài)學及生理生化試驗結果，可以初步判定GX05為假蕈狀芽孢桿菌。

2.3 單因素優(yōu)化結果

2.3.1 不同氮源對酶活的影響

保持碳源不變，選取不同的氮源，接種5 %的種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定α-淀粉酶酶活力，結果如圖4所示，其中以尿素為氮源時淀粉酶活力最高，硫酸銨次之，因此選擇尿素為最佳氮源。2.3.2 不同碳源對酶活的影響

在最佳氮源確定后，改變固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，當以葡萄糖為碳源加入固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h時，酶活力最高，其他碳源對酶活力的增加效果不明顯。最終選擇葡萄糖為最佳碳源，如圖5。

2.3.3 初始 pH 的影響

選用上述優(yōu)化好的碳源和氮源，調節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，在其他成分及培養(yǎng)條件不變的情況下測定發(fā)酵24 h的酶活力，其中當初始 pH 為 6.0時，有利于產(chǎn)生α-淀粉酶，此時產(chǎn)酶活力最高。因此選擇發(fā)酵初始pH為6.0，見圖6。

2.3.4 不同接種量對酶活的影響

經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，按照不同比例的接種量3 %、5 %、7 %、9 %、11 %、13 %、15 %，接入種子液，50 ℃培養(yǎng) 52 h后測定酶活力。結果如圖7所示，接種量為11 %時酶活力為最好。隨著菌體接種量的增大，培養(yǎng)基的消耗速度也在加快，這樣不利于產(chǎn)物的合成，因此接種量為11 %最合適。

2.3.5 不同發(fā)酵時間對酶活的影響

結合已經(jīng)確定的最佳發(fā)酵條件，通過調整不同的發(fā)酵時間24、36、48、60、72、84、96 h后，對酶活力進行測定。由圖8可知，產(chǎn)酶適宜發(fā)酵時間為60～84 h，在此時間范圍內，產(chǎn)酶能力逐漸增強，并且在 72 h時酶活力達到最高，但是72 h 過后，產(chǎn)酶能力增速放緩，因此確定發(fā)酵時間為72 h。

2.4 正交試驗

綜合以上各單因素試驗結果，選定尿素為最佳氮源，葡萄糖為最佳外加碳源，選擇pH（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）設計3因素3水平的 L9（33） 正交試驗（表3），試驗結果見表4。

依據(jù)正交試驗的直觀分析結果，3 個因素對α-淀粉酶酶活力的影響大小依次為：發(fā)酵時間（C） > pH（A）>接種量（B），其中發(fā)酵時間對淀粉酶酶活的影響較為顯著。由表4可知，4號試驗組組合酶活力大小最高，為175.99 U/g。由均值K得出的最佳組合為A2B3C2，即pH值為6， 接種量13 % ，培養(yǎng)時間72 h。在此條件下進行驗證試驗，酶活為180.12 U/g。由表5正交試驗方差分析可知，發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物α-淀粉酶酶活的影響顯著，pH值和接種量對試驗的結果沒有顯著性影響。

3 結論

從高溫大曲中篩選得到的8株產(chǎn)醬香的細菌為研究對象，利用透明圈初篩和固體發(fā)酵復篩從中篩選出1株高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，酶活為66.55 U/g，經(jīng)鑒定為假蕈狀芽孢桿菌屬（Bacillus pseudomycoides）。同時對該菌株產(chǎn)酶條件進行研究，最適條件為外加碳源為葡萄糖，外加氮源為尿素，初始pH 6， 接種量13 % ，培養(yǎng)時間72 h，此時酶活可以達到180.12 U/g。國內學者對產(chǎn)生淀粉酶的芽孢桿菌的篩選、芽孢桿菌淀粉酶的性質、基因序列分析等也作了大量的研究。張麗蘋等[13]從土壤中篩選出1株能產(chǎn) 2 種α-淀粉酶的脂肪芽孢桿菌， 測定其發(fā)酵液酶活為70 U/ mL。盧濤等[7]分離到1株產(chǎn)α-淀粉酶的凝結芽孢桿菌， 經(jīng)過誘變篩選后發(fā)酵液酶活達 100 U/mL。李習等[6]從白云邊高溫大曲中篩選出1株高產(chǎn)α-淀粉酶活力的地衣芽孢桿菌，并利用該菌制備功能性強化麩曲模擬酒廠的固態(tài)發(fā)酵過程，通過氣相色譜分析得到加入該菌株強化麩曲的基酒的出酒率高，總酸和總酯含量也較高。

由于傳統(tǒng)優(yōu)質大曲的生產(chǎn)受到地理、氣候、水質等環(huán)境條件以及在此環(huán)境中滋生和孕育的其他微生物的影響，從而阻礙了制曲生產(chǎn)異地化發(fā)展[14]。本研究從當?shù)鼐茝S的高溫大曲中篩選高液化力功能菌株，進一步改良大曲發(fā)酵功能菌群，為制曲生產(chǎn)異地化再現(xiàn)奠定基礎。由于時間的問題，實驗還是存在著不足。菌種產(chǎn)酶是多樣的，液化酶只是其中一種，后期工作中將會對該菌株多種酶的代謝，以及關于菌株功能特性和大曲風味成分之間的聯(lián)系做進一步研究。

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Abstract：A bacterial strain GX05 with high-yield of α-amylase was screened from 8 Maotai-flavor microbial species isolated from high-temperature Daqu by the detection of transparent circle of α-amylase and its activity. It was identified as Bacillus pseudomycoides through 16S rDNA gene phylogenetic analysis. The fermentation conditions for α-amylase production optimized by the single factor experiments and the orthogonal experiments with strain GX05： glucose as external carbon source， urea as external nitrogen source， initial pH6， inoculum concentration 13%， and fermentation time 72 h； under the optimal conditions， the α-amylase activity of strain GX05 reached 180.12 U/g.

Key words：Maotai-flavor strain； α-amylase； isolation and identification；enzyme activity