賀永國 李哲 黃綿佳 曾憲海 林位夫 劉潔瓊 張春紅 馬曉曉
摘要:【目的】克隆橡膠樹乳管特異性強啟動子HEV2.1(PHEV2.1),構(gòu)建天然橡膠生物合成途徑關(guān)鍵限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特異性植物表達載體,為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)?!痉椒ā扛鶕?jù)已報道的HEV2.1序列(GenBank登錄號AY247789.1)設(shè)計1對特異引物,采用PCR從橡膠樹熱研7-33-97基因組DNA中克隆PHEV2.1,與HbHMGR1基因融合構(gòu)建橡膠樹乳管特異性植物表達載體,并以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進行鑒定?!窘Y(jié)果】用特異引物可從熱研7-33-97基因組DNA中擴增獲得1852 bp的PHEV2.1片段,其與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%。將PHEV2.1與HbHMGR1基因融合構(gòu)建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證明植物表達載體構(gòu)建成功?!窘Y(jié)論】將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。
關(guān)鍵詞: 橡膠樹;乳管特異性啟動子PHEV2.1;HbHMGR1基因;植物表達載體;構(gòu)建;鑒定
中圖分類號: S794.1 文獻標志碼:A 文章編號:2095-1191(2016)02-0163-06
0 引言
【研究意義】轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達調(diào)控的主要環(huán)節(jié),對植物啟動子功能進行研究不僅可以揭示相應(yīng)基因的表達模式,還能為利用植物基因工程技術(shù)實現(xiàn)基因的高效特異性表達提供有效途徑。橡膠蛋白(Hevein)是膠乳的主要成分,可在乳管中高效表達,占可溶性蛋白質(zhì)的50%~70%,其基因家族成員HEV2.1基因啟動子是乳管特異表達的強啟動子(Van Parijs et al.,1991;Montoro et al.,2008)。橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1(HbHMGR1)是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶(Lynen,1969;Chye et al.,1992;馬曉曉等,2014),因此利用HEV2.1基因啟動子和HbHMGR1基因構(gòu)建乳管特異性表達載體以轉(zhuǎn)化橡膠樹,對提高橡膠樹的產(chǎn)量具有重要意義。【前人研究進展】早在20世紀60年代橡膠蛋白就已被認識(Archer,1960),但在隨后的40年間除Broekaert等(1990)成功克隆獲得過一個編碼橡膠蛋白的cDNA序列(GenBank登錄號M36986)外,有關(guān)編碼橡膠蛋白基因及啟動子的研究鮮有報道。2005年,Pujade-Renaud等利用文庫篩選法從橡膠樹基因組DNA中分離獲得5個編碼橡膠蛋白的基因,首次證明橡膠蛋白是由一個小基因家族所編碼;同時克隆獲得HEV1.1啟動子(PHEV1.1)和HEV2.1啟動子(PHEV2.1),并融合uidA基因轉(zhuǎn)化水稻,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子均能在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動uidA基因的表達,且以PHEV2.1的功能最強,能驅(qū)動uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平表達。Montoro等(2008)利用PHEV2.1融合uidA基因,并轉(zhuǎn)化橡膠樹分析其表達特性,結(jié)果表明,PHEV2.1驅(qū)動uidA基因在根、莖、葉的乳管中特異性強表達,印證了Archer等(1969)關(guān)于橡膠蛋白在乳管細胞中特異性表達的觀點;隨后還發(fā)現(xiàn)PHEV2.1可受光誘導(dǎo),驅(qū)動uidA基因在葉片所有細胞類型中表達。【本研究切入點】目前尚無利用PHEV2.1構(gòu)建HbHMGR1乳管特異性表達載體的研究報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過提取橡膠樹高產(chǎn)品種葉片基因組DNA,克隆橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1,用其構(gòu)建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,以期為下一步橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97的幼嫩葉片采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所橡膠樹國家種質(zhì)圃,用于提取基因組DNA。植物表達載體pCAMBIA2301-MCS(T-DNA:35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A)與HbHMGR1基因由農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室提供;pCAMBIA3301載體由海南大學畢政鴻惠贈;大腸桿菌Trans5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;克隆載體pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自美國Omega公司;限制性內(nèi)切酶Hind III、Pst I和Xma I購自美國NEB公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA提取 橡膠樹葉片基因組DNA提取參照鐘淦彬等(2010)和鄒智等(2014)的方法進行小量提取。
1. 2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1克隆 根據(jù)Pujade-Renaud等(2005)報道的HEV2.1序列(NCBI登錄號AY247789)截取起始密碼子前的1830 bp堿基序列,用Primer 5.0設(shè)計1對特異性引物PHF1(5'-CCC
因組DNA為模板,以PHF1和PHR1為引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾“A”后,克隆至pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,經(jīng)12~16 h的培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測,選取PCR檢測呈陽性的菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTn工具進行序列同源性分析。
1. 2. 3 HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構(gòu)建及酶切鑒定 分別以Xba I和Xma I對pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1進行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段,將兩片段用T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測,提取陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGR1;再用Hind III和Pst I分別對pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1進行雙酶切,電泳結(jié)束后對pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段進行切膠回收,回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR檢測,提取陽性重組質(zhì)粒,并用Hind III、Pst I和Xma I對其進行酶切鑒定,確認是否得到陽性重組質(zhì)粒為pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1;最后用Hind III和Xma I將PHEV2.1-HbHMGR1重組片段從pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下,將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I間,獲得植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,挑取單菌落進行菌落PCR,提取陽性重組質(zhì)粒,用Hind III和Xma I進行酶切鑒定,確認HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構(gòu)建是否成功。
2 結(jié)果與分析
2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA的提取結(jié)果
從橡膠樹熱研7-33-97的葉片中小量提取基因組DNA,取2.0 μL稀釋5倍后進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測其純度。由圖1可以看出,提取獲得的橡膠樹葉片基因組DNA條帶整齊、清晰、完整性好、無明顯的雜質(zhì)和降解現(xiàn)象。利用微型紫外分光光度計測定,其濃度約100 ng/μL。
2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1的克隆及序列分析結(jié)果
以橡膠樹熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板,用特異性引物PHF1和PHR1進行PCR擴增,獲得一條近2000 bp左右的條帶。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序結(jié)果證實,從熱研7-33-97基因組中擴增獲得的PHEV2.1為1852 bp。將所獲得的序列錄入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫(http://blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-
rch&LINK_LOC=blasthome)與Pujade-Renaud等(2005)報道的PHEV2.1序列(GenBank登錄號AY247789.1)進行同源性比對分析,結(jié)果顯示,克隆獲得的PHEV2.1啟動子序列與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%,相對于AY247789.1啟動子序列(以此堿基序號為準),其差異主要表現(xiàn)為:164G突變?yōu)門,475T和476T間多了一個AT, 582T突變?yōu)锳,591T和592T間多了一段CACA
TATTTTGCCTCTGTT序列,845C突變?yōu)門,874A和875T間多了一個A。
2. 3 植物表達載體的酶切鑒定結(jié)果
分別采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行酶切,其中,三酶切獲得一條與雙酶切等同的大片段和一條近2000 bp的條帶,近2000 bp的條帶為大小相近的PHEV2.1片段(1852 bp)和HbHMGR1片段(1728 bp),兩者由于大小相近而重疊顯示為一條條帶。此外,雙酶切獲得的小片段介于3000~5000 bp,與3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重組片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行PCR擴增,也獲得一條介于3000~5000 bp的條帶,與雙酶切獲得的小片段一致,說明中間植物表達載體pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已構(gòu)建成功。
提取質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1,以pCAMBIA2301-MCS為陰性對照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1為陽性對照,分別采用Hind III和Xma I對其進行雙酶切,結(jié)果表明,pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1經(jīng)雙酶切后得到一條與陽性對照小片段等同且介于3000~5000 bp的小片段和一條在10000 bp以上的大片段,小片段與PHEV2.1-
3 討論
由于生物具有遺傳多樣性,即使是同一物種不同品種間的基因組DNA在遺傳組成上也存在差異,從不同品種基因組中克隆獲得的同源啟動子也時有差異。魯旭(2014)在研究橡膠樹HbFCA功能時,用DNAMAN軟件對比了克隆自熱研7-33-97、邊沁橡膠、少花橡膠、光亮橡膠、光亮矮生橡膠、2131野生種、色寶橡膠、熱研幼花和熱研預(yù)測等9個橡膠樹品種的HbFCA啟動子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個品種的HbFCA啟動子同源性為98.77%,其中熱研幼花與熱研預(yù)測的相似性達99.95%。這種現(xiàn)象同樣存在于單子葉植物中,蕭鳳回(2008)通過分析大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)基因LEA啟動子,發(fā)現(xiàn)克隆自不同品種的同源啟動子序列間均存在一定差異。本研究根據(jù)Pujade-Renaud等(2005)報道的PHEV2.1序列(GenBank登錄號AY247789.1)設(shè)計引物,以橡膠樹熱研7-33-97的基因組DNA為模板,多次PCR擴增均獲得一段1852 bp的序列,經(jīng)BLASTn比對分析證實,多次克隆獲得的序列均相同,但與Pujade-Renaud等(2005)克隆自橡膠樹品種RRIM600的PHEV2.1序列略有差異,同源性為98.6%。
HbHMGR1是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶(Lynen,1969;Chye et al.,1992;馬曉曉等,2014),其基因在乳管中特異性表達(Chye et al.,1991)。因此,提高HbHMGR1基因在橡膠樹乳管中的表達量,對促進橡膠的生物合成及提高其產(chǎn)量具有重要意義。原始的植物表達載體pCAMBIA2301理論上只有唯一的1個Pst I限制性酶切位點,但實際應(yīng)用中的pCAMBIA2301載體上常存在2個突變增加的Pst I酶切位點。為此,本研究將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上,經(jīng)雙酶切后再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-
PHEV2.1-HbHMGR1。該研究結(jié)果為進一步利用乳管特異性表達載體轉(zhuǎn)化橡膠樹及研究HbHMGR1基因在乳管中表達促進膠乳生物合成的機理奠定了基礎(chǔ)。
4 結(jié)論
將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構(gòu)建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上,能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建的難題,成功構(gòu)建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。
參考文獻:
魯旭. 2014. 橡膠樹HbFCA基因功能解析[D]. ??冢汉D洗髮W.
Lu X. 2014. Functional analysis of HbFCA gene in rubber tree (Hevea brasiliensis)[D]. Haikou:Hainan University.
馬曉曉,李哲,戴雪梅,畢政鴻,方家林,黃華孫,李運合,賀永國. 2014. 橡膠樹HbHMGR1基因克隆及其愈傷組織轉(zhuǎn)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報,45(5):818-823.
Ma X X,Li Z,Dai X M,Bi Z H,F(xiàn)ang J L,Huang H S,Li Y H,He Y G. 2014. Gene cloning of HbHMGR1 and genetic transformation of callus in Hevea brasiliensis[J]. Journal of Southern Agriculture,45(5):818-823.
蕭鳳回. 2008. 大麥、水稻干旱可誘導(dǎo)LEA基因啟動子的克隆及功能分析[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學.
Xiao F H. 2008. Cloning and functional analyses of LEA gene promoters drought-inducible in barley and rice[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University.
鐘淦彬,李維國,鄭學項,李海林,顏園園,易曉潔,陳祖興. 2010. 一種快速高效適于橡膠樹葉片AFLP分析的DNA提取方法[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學,30(5):1-5.
Zhong G B,Li W G,Zheng X X,Li H L,Yan Y Y,Yi X J,Chen Z X. 2010. A simple and effective DNA extraction method for AFLP analysis in Hevea brasiliensis Muell Arg[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture,30(5):1-5.
鄒智,劉建汀,莊美露,楊禮富. 2014. 橡膠樹AtSAG12同源基因的克隆與表達特性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報,27(5):2168-2172.
Zou Z,Liu J T,Zhuang M L,Yang L F. 2014. Molecular cloning and expression analysis of Arabidopsis SAG12 homologue from rubber tree(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,27(5):2168-2172.
Archer B L,Audley B O G,McSweeney G P,Tan C H. 1969. Studies on composition of latex serum and bottom fraction particles[J]. Journal of the Rubber Research Institute of Malaya, 21:560-569.
Archer B L. 1960. The proteins of Hevea brasiliensis latex. 4. Isolation and characterization of crystalline hevein[J]. The Biochemical Journal,75(2):236-240.
Broekaert I,Lee H I,Kush A,Chua N H,Raikhel N. 1990. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree(Hevea brasiliensis)[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,87(19):7633-7637.
Chye M L,Kush A,Tan C T,Chua H. 1991. Characterization of cDNA and genomic clones encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from Hevea brasiliensis[J]. Plant Molecular Biology,16(4):567-577.
Chye M L,Tan C T,Chua N H. 1992. Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis:hmg1 and hmg3 are differentially expressed[J]. Plant Molecular Biology,19(3):473-484.
Lynen F. 1969. Biosynthetic pathways from acetate to natural products[J]. Pure and Applied Chemistry,14(1):137-168.
Montoro P,Lagier S,Baptiste C,Marteaux B,Pujade-Renaud V,Leclercq J,Alemanno L. 2008. Expression of the HEV2.1 gene promoter in transgenic Hevea brasiliensis[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 94(1):55-63.
Pujade-Renaud V,Sanier C,Cambillau L,Pappusamy A,Jones H,Ruengsri N,Tharreau D,Chrestin H,Montoro P,Narangajavana J. 2005. Molecular characterization of new members of the Hevea brasiliensis hevein multigene family and ana-
lysis of their promoter region in rice[J]. Biochimica et Biophysica Acta,1727(3):151-161.
Van Parijs J,Broekaert W F,Goldstein I J,Peumans-Planta W J. 1991. Hevein:an antifungal protein from rubber-tree(Hevea brasiliensis) latex[J]. Planta,183(2):258-264.
(責任編輯 蘭宗寶)