茶樹(shù)油對(duì)2種農(nóng)業(yè)致病菌的抑菌效果

張麗 李霆格 楊文漢 曾媛 李婧 梅晶晶 趙安瑾 王健

摘 要 茶樹(shù)油具有良好的抑菌能力，在果蔬天然保鮮殺菌劑的開(kāi)發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。采用濾紙擴(kuò)散法測(cè)定不同濃度的茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌的離體抑制效果。結(jié)果顯示，茶樹(shù)油對(duì)這2種菌都具有良好的抑菌效果，且濃度增加，抑菌作用逐漸增強(qiáng)，對(duì)芒果炭疽菌和香蕉炭疽菌的EC50分別為339.13和143.10 μL/L。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)油 ；香蕉炭疽菌 ；芒果炭疽菌 ；抑菌率

分類(lèi)號(hào) S789；TQ658 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.011

Abstract Tea tree oil has good prospects in development and application of natural fresh-keeping preservatives in fruits， vegetables for its ability of anti-microbial effect. In this research in vitro inhibition effect of tea tree oil on Colletotrichum musae and C. gloeosporioides under different concentrations were studied with filter paper dispersion method. The results showed that the tea tree oil had significant inhibition on mycelial growth of the two fungi. As the concentration increased， the antimicrobial activity increased accordingly. The results of experiment revealed the EC50 of tea tree oil on C. gloeosporioides and C. musae were respectively 339.13 μL/L and 143.10 μL/L.

Keywords tea tree oil ； Colletotrichum musae ； Colletotrichum gloeosporioides ； antimicrobial rate

茶樹(shù)油（Tea tree oil，TTO） 是指取自于桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca L.）的數(shù)種植物的精油，其中最主要的一種為互葉白千層（M. alternifola），故又稱(chēng)為互葉白千層油，“茶樹(shù)油”是其商業(yè)名稱(chēng)[1]。茶樹(shù)油是一種無(wú)色或淺黃色液體，具有令人愉快的豆蔻氣味[2]。茶樹(shù)油具有廣譜抗菌、抗真菌、抗病毒和抗炎活性[3]，對(duì)痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，G+）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccus aureus，G+）、表皮葡萄球菌（Staphyloccusepidermidis，G+）具有較強(qiáng)的抑制作用[1]。它無(wú)毒、無(wú)腐蝕，且不會(huì)把細(xì)菌、病毒、微菌殺死，只是適當(dāng)?shù)囊种破渖L(zhǎng)[4]，其藥用價(jià)值使得它在外科、牙科和婦科臨床上都得到了廣泛應(yīng)用[5]。

香蕉炭疽病是香蕉果實(shí)采后最主要的病害之一，是由香蕉炭疽菌[C. musae （Berk. & Curt.） Arx.]引起，該病菌具有潛伏性，在香蕉幼果期就可侵入果實(shí)果皮內(nèi)部，直至果實(shí)成熟，癥狀才開(kāi)始顯現(xiàn)，如果不采取防治措施，會(huì)造成果實(shí)大量腐爛，嚴(yán)重影響香蕉的果實(shí)品質(zhì)和食用價(jià)值[6]。

芒果炭疽病是芒果生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害性最大的一種真菌病害，是由芒果炭疽菌（C. gloeosporioides Pens）引起。該病害具有潛伏性，芒果在幼果期染病后，病菌以侵染絲在果皮中滯育，不會(huì)引發(fā)癥狀，果實(shí)成熟時(shí)或儲(chǔ)運(yùn)期間才陸續(xù)表現(xiàn)癥狀，感病部分會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的黑色斑塊，與未感病部分有明顯的分界，會(huì)微下陷且有裂痕，最后導(dǎo)致果實(shí)變黑腐爛，嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。

炭疽病是熱帶蔬果采后的一種重要病害之一。目前，對(duì)于蔬果仍以化學(xué)殺菌劑為主，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑不僅會(huì)使病菌產(chǎn)生抗藥性，而且農(nóng)藥殘留還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染及威脅人類(lèi)健康等。因此，研究安全有效的防治措施勢(shì)在必行，其中生物防治是目前最有應(yīng)用前景的措施之一[8]。茶樹(shù)油是世界公認(rèn)的抗菌較好的植物精油[1]，它以一種膜破壞劑的形式發(fā)揮作用，通過(guò)破壞膜的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，從而達(dá)到抑菌的效果[9]。朱德明等[10]采用瓊脂培養(yǎng)基擴(kuò)散法研究茶樹(shù)油對(duì)芭蕉炭疽病菌的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05%濃度的茶樹(shù)油對(duì)其有明顯抑制效應(yīng)。但是由于茶樹(shù)油不易溶于水，采用瓊脂培養(yǎng)基擴(kuò)散法可能會(huì)降低抑菌效果。本研究利用濾紙擴(kuò)散法，測(cè)定茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽菌和芭蕉炭疽菌的抗菌效果，為利用茶樹(shù)油研制高效、低毒、綠色熱帶蔬果的抗病劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

茶樹(shù)油由海南大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試菌種

香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌由海南大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂20 g；去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌落直徑和抑菌率測(cè)定

選直徑為9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿，倒入PDA培養(yǎng)基，冷卻凝固后接入菌種。待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，用直徑為0.8 cm的打孔器在上述菌落邊緣切下帶菌培養(yǎng)基。將平板倒置，取一張直徑為9 cm的無(wú)菌濾紙置于皿蓋中央，吸取不同體積的茶樹(shù)油滴于濾紙片上，使其濃度分別為60、120、180、240、300、360 μL/L，用于香蕉炭疽病菌的測(cè)試；再吸取不同體積的茶樹(shù)油滴于濾紙片上，使其終濃度分別為50、100、200、300、400、500 μL/L，用于芒果炭疽病菌的測(cè)試。以濾紙上不添加茶樹(shù)油的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照。每處理重復(fù)3次。將接種后的培養(yǎng)皿密封后置于25℃培養(yǎng)箱中。接種2、4、6、8、10 d后，觀察記錄菌絲的長(zhǎng)勢(shì)，并測(cè)量培養(yǎng)皿的菌落直徑。待相應(yīng)對(duì)照培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿時(shí)停止觀察和測(cè)量。每個(gè)菌落按十字交叉法測(cè)量2次，取其平均值代表菌落的大小，抑菌率計(jì)算公式為：

抑菌率（%）=（dC-dT）×100/（dC-0.8）。

式中，dC：對(duì)照菌落直徑（cm）；dT：不同處理?xiàng)l件下的菌落直徑（cm）；0.8：接種菌塊的直徑（cm）。

1.2.2 數(shù)據(jù)記錄與分析

采用Excel 和DPS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度茶樹(shù)油對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影晌

2.1.1 芒果炭疽菌菌絲生長(zhǎng)速率

不同濃度的茶樹(shù)油處理后，芒果炭疽菌菌絲生長(zhǎng)速率不同，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，與空白試驗(yàn)對(duì)照，加入茶樹(shù)油后芒果炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)速率都減緩、速率增長(zhǎng)梯度減小，在第4天的菌絲生長(zhǎng)直徑中，大于300 μL/L幾乎不長(zhǎng)菌絲，且隨著茶樹(shù)油濃度的逐步加大，菌絲的生長(zhǎng)速率越來(lái)越小、增長(zhǎng)梯度趨于平緩。當(dāng)茶樹(shù)油濃度為400和500 μL/L時(shí)，菌絲幾乎停止生長(zhǎng)，說(shuō)明茶樹(shù)油濃度大于400 μL/L時(shí)，對(duì)芒果炭疽菌菌絲的抑制效果明顯。

2.1.2 香蕉炭疽菌菌絲生長(zhǎng)速率

不同濃度的茶樹(shù)油處理后，香蕉炭疽菌菌絲生長(zhǎng)速率不同，結(jié)果見(jiàn)圖2。

與空白試驗(yàn)對(duì)照，加入茶樹(shù)油后的香蕉炭疽菌菌絲生長(zhǎng)速率也都減緩、速率增長(zhǎng)梯度也減小，隨著茶樹(shù)油濃度的逐步加大，菌絲的生長(zhǎng)速率越來(lái)越小、增長(zhǎng)梯度趨于平緩，且茶樹(shù)油的抑制效果很強(qiáng)，在對(duì)照組培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿菌絲時(shí)，濃度為360 μL/L組的菌絲幾乎不長(zhǎng)。但隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，抑菌作用在減小。茶樹(shù)油濃度為240～360 μL/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率接近，差異不顯著，說(shuō)明240 μL/L濃度的茶樹(shù)油即可對(duì)香蕉炭疽病菌產(chǎn)生明顯的抑制作用。

2.2 抑菌率

2.2.1 芒果炭疽病抑菌率

不同濃度茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病抑菌率變化如表1所示。

由表1可知，空白對(duì)照與加茶樹(shù)油有極顯著差異，說(shuō)明添加茶樹(shù)油可以顯著抑制芒果炭疽菌的生長(zhǎng)，處理50與100 μL/L、100與200 μL/L間無(wú)顯著差異，處理400與500 μL/L也無(wú)顯著差異?？梢缘贸?，茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病菌有一定的抑制作用，且隨著茶樹(shù)油濃度的增加，抑制率也增強(qiáng)，400 μL/L以上濃度可以達(dá)到較高的抑制效果。以EC50作為衡量茶樹(shù)油對(duì)不同病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性大小的指標(biāo)，茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病菌的EC50為339.13 μL/L。

2.2.2 香蕉炭疽菌抑菌率

不同濃度茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽菌抑菌率變化見(jiàn)表2。

由表2可知，空白對(duì)照組與加茶樹(shù)油組有極顯著差異，處理60與120 μL/L、180與240 μL/L間有顯著差異，處理120與180 μL/L無(wú)顯著差異，處理240與300 μL/L、300與360 μL/L間也無(wú)顯著差異。說(shuō)明茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽病菌有一定的抑制作用，且濃度越大，抑制效果越顯著。240 μL/L的濃度可以達(dá)到80%以上的抑菌率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

不同濃度茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病菌和香蕉炭疽病菌均有抑制活性，隨著濃度的不斷增加，茶樹(shù)油的抑菌作用越強(qiáng)，當(dāng)茶樹(shù)油濃度大于400 μL/L時(shí)，芒果炭疽病菌菌絲的抑菌效果顯著；大于240 μL/L時(shí)，對(duì)香蕉炭疽病菌的抑制效果顯著。茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病菌的EC50為339.13 μL/L，對(duì)香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L，說(shuō)明茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽菌抑制作用比芒果炭疽菌強(qiáng)。

3.2 討論

目前，控制果蔬采后病害的主要手段是使用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)殺菌劑對(duì)人類(lèi)健康及自然環(huán)境都有嚴(yán)重危害和影響，因此，這一問(wèn)題已受到全世界關(guān)注[11]。如果品生產(chǎn)中通常采用波爾多、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥對(duì)鮮果進(jìn)行處理，以減少果品貯藏運(yùn)輸過(guò)程中的損失及病蟲(chóng)害。運(yùn)用此方法處理的果品，食用安全性差，難以達(dá)到綠色食品衛(wèi)生要求[10]。茶樹(shù)油是目前所知活性最強(qiáng)的天然抗菌劑，可高效、無(wú)毒、無(wú)刺激地殺死真菌和細(xì)菌[12]。在國(guó)際上，茶樹(shù)油已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化工等領(lǐng)域[12-13]。茶樹(shù)油作為食品香料使用，早已獲得美國(guó)的批準(zhǔn)（FEMA號(hào)3902）[13]。茶樹(shù)油在焙烤食品、軟飲料、谷類(lèi)早餐、糖果、油脂、冷凍乳制品、水果制品、糧食制品等中的平均使用濃度為10 mg/kg，平均最高濃度為50 mg/kg[13]。2003年，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的公告中，已將茶樹(shù)油列入食品香料名單[14]。這些都說(shuō)明茶樹(shù)油是一種高效、低毒、安全的殺菌劑，使用茶樹(shù)油作為果蔬采后的生物殺菌劑，具有廣闊前途。

朱德明等[10]采用瓊脂培養(yǎng)基擴(kuò)散法對(duì)茶樹(shù)油對(duì)芭蕉炭疽病菌的抑制作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)0.05%濃度的茶樹(shù)油對(duì)其有明顯抑制效應(yīng)。靜瑋等[15]以香蕉果實(shí)為材料，采用菌絲生長(zhǎng)速率方法測(cè)定不同劑量（0～40 μL）的茶樹(shù)油及其主要成分（4-松油烯醇、α-松油醇、γ-松油烯和1.8-桉葉油素）對(duì)香蕉炭疽病菌的離體抗菌活性影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，20～40 μL茶樹(shù)油能顯著抑制炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)，且濃度越高，抑制效果越明顯；接種炭疽病菌的果實(shí)經(jīng)茶樹(shù)油處理后，病斑直徑顯著小于未處理果實(shí)。本研究采用濾紙擴(kuò)散法，得到茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽病菌的EC50為143.10 μL/L，說(shuō)明茶樹(shù)油的揮發(fā)擴(kuò)散蒸汽也可有效抑制香蕉炭疽病菌，與靜瑋等[15]的研究結(jié)果一致。

張胡煥等[16]采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定10種常用殺菌劑對(duì)芒果炭疽病菌的毒力。結(jié)果表明：45%咪鮮胺EW對(duì)芒果炭疽病菌生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，其EC50值為0.01 mg/L；40%氟硅唑EC、25%丙環(huán)唑EC、95%苯醚甲環(huán)唑TC、50%撲海因WP的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，其EC50值為0.03～0.81 mg/L；96%睛菌唑TC、15%三唑酮WP、96%百菌清TC、30%醚菌酯WP的抑制作用較小，其EC50值為4～65.2 mg/L；50%代森錳鋅WP抑制作用最小，其EC50值為105.0 mg/L。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，茶樹(shù)油對(duì)芒果炭疽病菌EC50為339.13 μL/L，比大部分的化學(xué)殺菌劑都要低，更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，茶樹(shù)油對(duì)香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有明顯的抑制作用，而且具有安全無(wú)毒，操作方便的優(yōu)勢(shì)，在以后香蕉炭疽病和芒果炭疽病的防治中，茶樹(shù)油具有廣闊的應(yīng)用前景。

致 謝 感謝海南大學(xué)園藝園林學(xué)院從心黎老師提供的香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌材料，特此致謝！

參 考 文 獻(xiàn)

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