海南芒果蒂腐病可可球二孢抗藥性及遺傳多樣性分析

王萌　陳小莉　趙磊　卜小莉　王莉巧　曾宇松　楊葉

摘 要 探索海南芒果蒂腐可可球二孢（Botryodiplodia theobromae）的抗藥性、培養(yǎng)特性及遺傳多樣性的關(guān)系。以區(qū)分劑量法檢測30個菌株對10種殺菌劑的敏感性，采用RAPD技術(shù)對菌株的遺傳多樣性進行分析。研究表明，芒果可可球二孢菌株對多菌靈、甲基硫菌靈、醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽7種殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，抗性菌株比率（MR和HR）分別為66.67%、70.00%、90.00%、76.67%、53.33%、20.00%和16.67%。供試菌株的培養(yǎng)特性存在明顯差異。應(yīng)用6個隨機引物對共擴增出64條帶，DNA多態(tài)率高達90.6%，遺傳距離在0.58～0.86，芒果蒂腐病菌遺傳分化較大。在遺傳距離為0.65時，可分為兩個群，群Ⅰ分成3個類群，共有26個菌株，群Ⅱ分成2個類群。聚合類型與菌株的抗藥性表現(xiàn)一致。菌株的致死溫度與聚合類型、抗藥性有一定的關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞 芒果；可可球二孢；抗藥性；RAPD分析；培養(yǎng)特性

中圖分類號 S436.67 文獻標識碼 A

Abstract The objective of the present study was to reveal the relationship among fungicide resistance， culture characteristics and genetic diversity of Botryodiplodia theobromae from mango in Hainan. The resistance of 30 strains to 10 fungicides was evaluated by a distinguishing dosage method. RAPD assay was used to reveal the genetic diversity. The results showed that strains showed different level of resistance to 7 tested fungicides. The frequency of resistant strains（MR and HR） to carbendazim， thiophanate-methyl， kresoxim-methyl， azoxystrobin， pyraclostrobin， difenoconazole and prochloraz was 66.67%， 70.00%， 90.00%， 76.67%， 53.33%， 20.00% and 16.67%， respectively. The culture characteristics of the 30 strains appeared diversified. RAPD-PCR analysis showed that the genetic diversity among the tested isolates was high. A total of 64 bands were amplified by 6 RAPD primers，polymorphic bands accounted for 90.6% with genetic distance between 0.58-0.86. All the strains could be classified into 2 genetic groups at the genetic distance of 0.65. Cluster Ⅰcould be classified into 3 subgroups， and cluster Ⅱ could be classified into 2 subgroups. The resistance of the strains showed significant correlation with the RAPD groups. The RAPD groups， fungicide resistance correlated with the lethal temperature.

Key words Mango；Botryodiplodia theobromae；Fungicide resistance；RAPD analysis；Culture characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.019

芒果蒂腐病主要為害芒果果實，導(dǎo)致芒果在貯藏、運輸期間嚴重腐爛，造成嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，有10多種真菌可引起芒果蒂腐病，部分真菌為混合侵染[1-2]，海南芒果蒂腐病主要是由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae，異名： Lasiodiplodia theobromae）引起，該病菌在世界各芒果種植地均有發(fā)現(xiàn)[3-4]?？煽汕蚨哌€可引起500多種植物病害的發(fā)生，除了造成果實腐爛，還可引起致苗枯和枝條枯死[5]。此外，該病菌具有潛伏侵染的特性，病菌早在田間就已侵染芒果果實，在采后貯藏運輸期間才發(fā)病，造成果實腐爛，帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

海南芒果產(chǎn)量、種植面積皆位居全國首位，然而病害的發(fā)生嚴重制約著芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在芒果種植期間及采收后均大量應(yīng)用苯并咪唑類（BMZs）等殺菌劑防治病害。2009年就有芒果可可球二孢（B.theobromae）對多菌靈、甲基硫菌靈、醚菌酯和烯唑醇等殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報道[6]，2014年，本課題組從海南采集分離到大量對多菌靈等殺菌劑存在抗藥性的可可球二孢菌株[7]。目前，有關(guān)芒果可可球二孢遺傳多樣性方面的研究沒有報道，而病菌的抗藥性與遺傳分化、培養(yǎng)特性與群體遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究工作，對于深入了解病菌具有重要的作用。因此，本研究針對海南芒果可可球二孢抗藥性與菌株培養(yǎng)特性、遺傳變異的相互關(guān)系加以探討，探索殺菌劑的使用對病原菌群體遺傳多樣性的影響，以期為芒果蒂腐病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的30個芒果可可球二孢菌株均為單孢分離物，其中，樂東菌株14個、三亞菌株11個、昌江菌株5個。

供試10種殺菌劑，分別是：瑞士先正達作物保護有限公司的丙環(huán)唑（25%乳油）、苯醚甲環(huán)唑（10%水分散粒劑）和嘧菌酯（25%乳油）；拜耳作物科學(xué)有限公司的咪鮮胺錳鹽（50%可濕性粉劑）、戊唑醇（43%可濕性粉劑）和異菌脲（50%懸浮劑）；德國巴斯夫的吡唑醚菌酯（25%乳油）和醚菌酯（50%乳油）；四川國光農(nóng)化股份有限公司的多菌靈（50%可濕性粉劑）和江蘇龍燈化學(xué)有限公司的甲基硫菌靈（70%可濕性粉劑）。

本試驗采用20條RAPD引物的合成序列如表1，由上海生工生物工程有限公司合成；10×Mix、瓊脂糖、50×TAE均購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 殺菌劑敏感性測定 采用生長速率法，針對30個芒果可可球二胞菌株對10種殺菌劑的敏感性進行初步檢測。將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)4 d后，在菌落邊緣打取菌餅（ф=5 mm），分別移到含藥PDA平板中央，每個藥劑處理各有3個皿，28 ℃培養(yǎng)36 h后，以十字交叉法測量菌落直徑。試驗重復(fù)3次，計算平均值。參照Byungsup[8]和匡靜等[9]的方法以10和100 mg/L為區(qū)分劑量；結(jié)合吳永官等[10]的方法進行抗性等級的劃分：在含10 mg/L（質(zhì)量濃度）的PDA上菌落直徑小于空白對照的40%為敏感菌株（SS）；在10 mg/L的PDA上菌落直徑大于空白對照的40%，但在100 mg/L的PDA上菌落直徑小于空白對照的40%為中等抗性菌株（MR）；在100 mg/L的PDA上菌落直徑超過空白對照的40%為高抗菌株（HR）。測定甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性時，含藥培養(yǎng)基中還加入150.0 mg/L的水楊肟酸以降低旁路呼吸途徑對該類殺菌劑的影響。

1.2.2 培養(yǎng)特性和致死溫度測定 將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)3次，自然光照，28 ℃培養(yǎng)36 h，用十字交叉方法測量菌落的直徑。培養(yǎng)20 d，每皿（9 cm）加入10 mL 0.1%吐溫80的無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，將該孢子懸浮液置于已滅菌燒杯內(nèi)、振蕩混勻制成孢子懸浮液，用血球板計數(shù)器計算產(chǎn)孢量。采用瓊脂玻片法測定孢子的萌發(fā)率[11]，于28 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)4.5 h后觀察計算孢子的萌發(fā)情況，每個菌株測量300個孢子。

菌絲致死溫度的測定：在含3 mL無菌水的試管中加入菌餅（Ф=5 mm），分別置于50、52、54、56、58、60、62、和64 ℃的恒溫水浴鍋，每個溫度3個試管，每個試管在處理10 min后用冰水迅速冷卻，然后再將菌餅接種于PDA平板中央，再置于28 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察菌絲生長情況。

1.2.3 菌株基因組DNA的提取及PCR擴增 從培養(yǎng)3 d的菌落邊緣挑菌絲約0.3 g于1.5 mL的離心管中，采用CTAB法提取菌株基因組DNA備用。PCR 擴增體系為20.0 μL，其中 1.0 μL隨機引物，10.0 μL 2×PCR通用Mix，1.0 μL DNA，余下體積以超純水補齊20.0 μL。PCR 擴增條件為 94 ℃預(yù)變性2 min 后進入循環(huán)，94 ℃變性1 min， 36 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)，后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增反應(yīng)完畢后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓50～100 V，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0分析軟件，采用Duncans新復(fù)極差法統(tǒng)計分析。按電泳結(jié)果對DNA 條帶的有無分別賦值“1”或“0”并進行統(tǒng)計，利用NTSYS-PC2.10e分析軟件進行兩兩菌株間的遺傳相似系數(shù)分析，并構(gòu)建UPGMA 聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對殺菌劑的敏感性

供試30菌株對10種藥劑初步檢測結(jié)果表明，海南芒果可可球二孢對苯并咪唑類殺菌劑存在嚴重抗藥性，高抗菌株數(shù)量超過50%，對多菌靈敏感（SS）、中抗（MR）及高抗（HR的菌株分別占33.33%、6.67%和60.00%，抗藥性菌株共有20個；對甲基硫菌靈敏感（SS）、中抗（MR）及高抗（HR的菌株分別占30.00%、10%和60.00%，抗藥性菌株共有21個，病菌對兩種殺菌劑均表現(xiàn)出抗藥性（表2）。該病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗性也非常突出，對醚菌酯敏感（SS）、中抗（MR）及高抗（HR）的菌株分別占10.00%、40.00%和50.00%，抗藥性菌株共有27個；對嘧菌酯敏感（SS）、中抗（MR）及高抗（HR的菌株分別占23.33%、26.67%和50.00%，抗藥性菌株共有23個；對吡唑嘧菌酯敏感（SS）、中抗（MR）及高抗（HR）的菌株分別占46.67%、36.67%和16.67%，抗藥性菌株共有16個。供試芒果可可球二孢菌株對甾醇生物合成抑制劑的抗性與前面兩類殺菌劑相比，抗性菌株少且抗性水平低，對苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)中抗菌株有6株，占20%；咪鮮胺錳鹽的抗菌株5個，占16.67%；其中，戊唑醇和丙環(huán)唑沒有發(fā)現(xiàn)抗性菌株。二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲也沒有發(fā)現(xiàn)抗性菌株。

2.2 培養(yǎng)特性

芒果可可球二孢菌絲生長速度很快，在PDA培養(yǎng)基上一般40 h后可長滿直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)36 h多數(shù)菌株的菌落直徑在5～6 cm之間，部分菌株之間存在顯著差異（p<0.05）（表2）。培養(yǎng)20 d后，不同菌株之間的產(chǎn)孢量差異很大，產(chǎn)孢量在3.0×106～156.37×106之間，最高產(chǎn)量與最低產(chǎn)量相差52倍，菌株之間存在明顯差異（p<0.05）?？偟膩碚f，芒果可可球二孢菌株具有很高的萌發(fā)率，培養(yǎng)4.5 h有25個菌株萌發(fā)率在71.0%～90.1%之間。試驗表明，不同菌株的致死溫度的差異也很大，在52～64 ℃之間。

從表2可以看出，菌株產(chǎn)生抗藥性與菌株的培養(yǎng)特性并沒有直接的聯(lián)系。但是，不同菌株致死溫度的差異與菌株的抗藥性水平表現(xiàn)出一定的規(guī)律，如：對多菌靈、甲基硫菌靈、醚菌酯和嘧菌酯4種殺菌劑均表現(xiàn)為高抗的菌株有7個，致死溫度在60～64 ℃之間，對高溫表現(xiàn)出較高的耐受性；而對多菌靈和甲基硫菌靈均表現(xiàn)為敏感的菌株有9個，其中，有6個菌株的致死溫度在52～54 ℃之間，另外3個菌株SYTN72601、YM11602和TN11002的致死溫度分別為64、58和60 ℃，但它們對醚菌酯和嘧菌酯表現(xiàn)為高抗。

2.3 RAPD分析

2.3.1 菌株 RAPD 擴增結(jié)果及聚類分析 以來源、培養(yǎng)性狀、抗藥性等有差異的4個菌株基因組DNA為模板，從20個10堿基的隨機引物中篩選出OPE-15、OPP-06、S286、OPQ-05、OPP-02、OPT-05 6個隨機引物，對30個菌株進行RAPD分析。這6個引物擴增的DNA片斷具有清晰、帶型穩(wěn)定、條帶多、多態(tài)性好及擴增重復(fù)性好的特點。6個引物對30個芒果可可球二孢菌株進行PCR擴增，共產(chǎn)生64條清晰的條帶，58條具多態(tài)性，多態(tài)率達90.6%。不同菌株RAPD擴增產(chǎn)物有8～12條帶，集中在250～2 500 bp（圖1），其中主條帶6～9條，平均每條引物的條帶數(shù)10.7條。表明海南芒果可可球二孢菌株之間具有豐富的DNA多態(tài)性。

用NTSYS 軟件對擴增出的64條多態(tài)性條帶構(gòu)建UPGMA樹狀圖（圖2），30個菌株的遺傳距離在0.58～0.86之間，在遺傳距離0.58水平上被聚為一類，說明海南省芒果可可球二孢病菌遺傳分化明顯，群體遺傳結(jié)構(gòu)多樣性比較復(fù)雜。遺傳距離為0.65時，所有供試菌株分為兩個群，群Ⅰ分又成3個亞群，共有26個菌株，群Ⅱ分成2個亞群，僅有4個菌株。

2.3.2 抗藥性結(jié)合遺傳多樣性分析 研究結(jié)果表明，芒果可可球二孢菌株的抗藥性和遺傳基礎(chǔ)有很大的同步關(guān)系。群Ⅱ共有4個菌株，均對多菌靈和甲基硫菌靈表現(xiàn)敏感；群Ⅰ中多數(shù)菌株表現(xiàn)為抗藥性，抗性菌株比率為69.2%，群Ⅰa中抗性菌株比率為73.3%，群Ⅰc中抗性菌株比率為75.0%；對多菌靈抗性水平最高的4個菌株（抑制率小于10%）均出現(xiàn)在群Ⅰa，對嘧菌酯抗性水平最高的5個菌株（抑制率小于20%）有4個在其群Ⅰa，供試菌株中，DTN31605和DTN21602親緣關(guān)系很近，在高水平0.837上被聚為一類，說明這兩個菌株遺傳基礎(chǔ)相似，它們對多菌靈、甲基硫菌靈、醚菌酯、嘧菌酯和吡唑嘧菌酯均表現(xiàn)為抗藥；菌株HLTN42604和SYTN22602在高水平0.826上被聚為一類，對多菌靈、甲基硫菌靈均表現(xiàn)為抗藥，對嘧菌酯、嘧菌酯均為敏感。因此，上述菌株遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的差異可能是導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗藥性的因素之一。

2.3.3 培養(yǎng)特性結(jié)合遺傳多樣性分析 從表2可以看出，不同菌株在菌絲的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率等方面均存在較大的差異，通過上述培養(yǎng)特性結(jié)合遺傳多樣性分析表明，菌株在培養(yǎng)特性的差異與遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)并沒有太大的相關(guān)性。供試芒果可可球二孢菌株的致死溫度對病菌遺傳差異存在一定的關(guān)系，群Ⅰ中不同菌株致死溫度差異大，在52～64 ℃，其中群Ⅰb的3個菌株致死溫度在52～54 ℃，比較一致；群Ⅱ中所有菌株的致死溫度差異較小，在52～56 ℃。

3 討論與結(jié)論

利用RAPD分子標記方法對30個芒果可可球二孢病菌遺傳多樣性分析表明，30個供試菌株的遺傳分化較大，群體結(jié)構(gòu)多樣性豐富。海南各地收集的菌株的生長速度及孢子萌發(fā)都很快，這跟該菌在田間具有很強的生存競爭力有關(guān)。不同菌株在菌絲生長速率、產(chǎn)孢能力、分生孢子萌發(fā)能力及對溫度的敏感性方面有明顯的差異，但它們之間沒有相關(guān)性。Sangeetha等[12]對香蕉可可球二孢的研究表明，從不同香蕉品種分離到的菌株，形態(tài)、顏色及孢子均存在明顯差異，RAPD標記顯示菌株間遺傳多樣性豐富，聚類分析與菌株來源有明顯的相關(guān)性。菌株聚合類型與生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率并不一致，在每個基因類群里菌株都包含生長速率慢或快、產(chǎn)孢量少或多的菌株。

大量研究表明，苯并咪唑類殺菌劑存在高抗性風(fēng)險，是現(xiàn)有殺菌劑中抗性最為嚴重的藥劑，抗性機制主要是病菌β-微管蛋白基因發(fā)生突變所致[13-15]；甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是線粒體呼吸抑制劑，同樣存在很高的抗性風(fēng)險，抗性機制為細胞色素b基因（Cyt b）發(fā)生突變所致[16-18]。夏燁等[19]用RAPD隨機引物篩選出對三唑酮具有不同敏感性小麥白粉病菌株（Bulmeria graminis f. sp. tritici）的抗藥性DNA分子標記。朱志成[20]則通過RAPD分析獲得與病菌對三唑酮敏感性相關(guān)的標記，為進一步小麥白粉菌對三唑酮不同抗性建立起分子鑒定體系奠定基礎(chǔ)。本研究采用RAPD遺傳多樣性分析表明，各菌株對多菌靈等殺菌劑的敏感性和遺傳基礎(chǔ)有很大的同步關(guān)系，遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的差異可能是導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗藥性的重要因素。供試菌株對兩類藥劑的抗藥性即存在一致，又存在差異，并且遺傳物質(zhì)的差異也呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性，表明遺傳差異與病菌不同抗藥性密切相關(guān)。海南地區(qū)的芒果可可球二孢菌株因抗藥性不同而表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性的差別，這種差別應(yīng)該與芒果用藥歷史及用藥水平有關(guān)，意味著海南在芒果上頻繁大量的用藥導(dǎo)致病菌對多種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性并關(guān)聯(lián)表現(xiàn)出遺傳變異。

本項目針對病菌群體抗藥性、溫度敏感性和遺傳多樣性關(guān)系的研究表明，可可球二孢的遺傳多樣性和病原菌抗藥性之間具有明顯的關(guān)系。菌株的培養(yǎng)特性及抗藥性是影響海南可可球二孢病菌遺傳多樣性的主要因素，在病菌的遺傳變異以及病菌對殺菌劑的抗性方面起重要的作用。鑒于海南芒果可可球二孢對苯并咪唑類殺菌劑及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均產(chǎn)生較為嚴重的抗藥性，建議在海南芒果產(chǎn)區(qū)暫停使用苯并咪唑類及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，可改用作用機制不同的異菌脲、戊唑醇和丙環(huán)唑等殺菌劑交替輪換使用。

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