辣木果莢腐病病原菌分離及鑒定

蔡志英 曾艷華 熊斌 劉一賢 楊焱 龍繼明 殷振華 郭涵 李海泉

摘要：【目的】明確辣木果莢腐病病原菌種類及其分類地位，為辣木果莢腐病防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā繉υ颇鲜∥麟p版納州辣木種植基地感病、帶黑色顆粒物病殘體的辣木果莢進行癥狀觀察、病原菌分離培養(yǎng)、致病性測定、顯微形態(tài)特征觀察、ITS和β-tubulin基因序列分析。【結果】辣木果莢腐病病原菌的分生孢子不分隔、透明，孢子頂端呈尖錐形彎曲，基部平截，具油滴，大小為15.7～22.1 μm×2.5～4.3 μm；厚垣孢子壁厚，呈黑褐色，簇生或成鏈狀。該菌株ITS和β-tubulin基因的序列與Colletotrichum chlorophyti菌株IMI103806 的同源性高達99%（ITS登錄號：GU227894；TUB2登錄號：GU228188）。多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，供試菌株與蘭生炭疽菌（C. chlorophyti）具有很近的遺傳關系?！窘Y論】蘭生炭疽菌（C. chlorophyti）能侵染辣木引起果莢腐病，是為害辣木果莢的致病菌。

關鍵詞： 辣木；果莢腐爛病；致病菌；鑒定

中圖分類號： S435.79 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1517-05

Abstract：【Objective】In order to provide theory basis for controlling pod rot of Moringa oleifera， the pathogen was identified， and its taxonomic status was studied. 【Method】The infected M. oleifera pods with black particles were collected from M. oleifera planting base in Xishuangbanna， Yunnan province. Based on disease symptom observation， morphological characteristics of pathogen， pathogenicity， rDNA-ITS and β-tubulin gene sequence analysis， the pathogen causing pod rot of M. oleifera was identified. 【Result】The conidia of pathogen were aseptate， hyaline， smooth， curved with tapered ends and a truncated base， and ranged from 15.7-22.1 μm×2.5-4.3 μm in size. Chlamydospores were dark brown， thick-walled， and fascicled or catenulate. The gene sequences of ITS and TUB2 gene showed 99% homology with Colletotrichum chlorophyti strain IMI103806（ITS accession number： GU227894； TUB2 accession number： GU228188）. Multi-gene phylogenetic analysis showed that the tested strain had the closest genetic relationship with C. chlorophyti. 【Conclusion】C. chlorophyti can cause pod rot of M. oleifera， which is pathogen damaging pod of M. oleifera.

Key words： Moringa oleifera； pod rot； pathogen； identification

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa oleifera）原產(chǎn)印度，又稱鼓槌樹（Drumstick tree），屬辣木亞目辣木科辣木屬，在亞洲和非洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植，目前在我國南方的廣東、廣西、海南和云南等地亦有種植。辣木全株均可開發(fā)利用且用途廣泛，可供食用、藥用、觀賞及凈化水，也可用作油料作物、畜牧飼料、蜜源植物和薪材等（盛軍，2015），因其含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等被歐美國家視為新時代健康食品（劉昌芬，2013）。云南省西雙版納州于20世紀60年代引進辣木，2002年云南省熱帶作物科學研究所啟動辣木系統(tǒng)研究，在西雙版納建立了13.33 ha（200畝）實驗基地，進行辣木的引種、試種、評價及開發(fā)利用研究，目前已收集保存多油辣木（Moringa oleifera Lam.）、狹瓣辣木（M. stenopetala Cufod.）、象腿辣木（M. drouhardii Jum.）和北方辣木（M. concanensis Nimmo.）4個種及1個品種PKM1，通過多年的栽培試驗及評價，篩選出最具商業(yè)前景的多油辣木和品種PKM1。項目組研究發(fā)現(xiàn)，在高溫、高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)，辣木會受到各種病蟲害的侵害，其中，辣木果莢腐病是最嚴重的病害之一，尤其在降雨密集的7～8月可導致90%以上的果莢受害，嚴重時顆粒無收。因此，對辣木果莢腐病病原菌進行分離、鑒定，明確為害辣木的病原菌，對辣木果莢腐病的綜合防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前國內(nèi)外關于辣木的研究主要集中在其功能成分分析及栽培引種方面（張德等，2014；楊春梅等，2015），針對辣木病害的研究較少。Resmi等（2005）通過致病性測定和形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)鐮刀菌可為害辣木果莢。印度學者報道辣木果莢腐爛是由Drechslera（Cochliobolus） hawaiiensis病原菌侵害造成（Kshirsagar and D'Souza， 1989），而蔣桂芝等（2007）報道辣木果莢腐爛病的致病菌為半裸鐮孢（Fusarium semitectum Berk & Rav），暗示該病害可能存在多種病原菌?！颈狙芯壳腥朦c】本項目組在辣木果莢腐病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多受害果莢中有黑色小顆粒狀物的病原菌子實體，經(jīng)分離培養(yǎng)、顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其孢子形態(tài)多為新月形，不同于現(xiàn)有報道辣木果莢腐病致病菌產(chǎn)生的分生孢子。【擬解決的關鍵問題】為明確產(chǎn)生黑色小顆粒狀物的真菌是否為辣木果莢腐病的致病菌，本研究通過病原菌分離、致病性測定、形態(tài)特征結合多基因分析的方法對該病原菌進行鑒定，以期為生產(chǎn)上辣木果莢腐病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

有典型癥狀、帶黑色小顆粒病殘體的辣木果莢采自云南省熱帶作物科學研究所中古辣木合作基地，辣木品種均為PKM1。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌分離培養(yǎng) 切開辣木果莢，從病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm大小的辣木果肉組織塊，用70%酒精浸泡30 s，置于0.1%升汞溶液中消毒1.5 min，再用無菌水漂洗3次，無菌濾紙吸干水后置于PDA培養(yǎng)基中，于（25±1）℃、光照與黑暗各12 h交替條件下。恒溫培養(yǎng)3～7 d，待組織塊上長出菌落并產(chǎn)生大量分生孢子后，采用水瓊脂平板單孢子挑取法獲得單孢菌落（方中達，1998），移植到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后的單孢子菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1. 2. 2 致病力測定 用帶菌瓊脂塊田間活體接種法進行病原菌致病性測定。將辣木果莢表皮用滅菌芽簽刮傷，從培養(yǎng)4 d的菌落外緣切取直徑4 cm帶菌瓊脂塊接種到辣木果莢表皮刮傷處，菌絲面直接貼在傷口上，將濕棉球覆蓋于帶菌瓊脂塊上，然后用保鮮膜包裹接種部位，最后用防水紙袋將接種果莢套上，以接種純PDA培養(yǎng)基為對照，每處理接種10個果莢，從第2 d起隔日觀察、記錄果莢感病情況。經(jīng)柯赫氏法則確認為致病菌后開展后續(xù)試驗。

1. 2. 3 病原菌的形態(tài)觀察及鑒定 從單孢菌落外緣用打孔器取直徑約0.4 cm的帶菌瓊脂塊移植于PDA培養(yǎng)基，置于（25±1）℃、光照與黑暗各12 h交替條件下培養(yǎng)，觀察、記錄病原菌的培養(yǎng)性狀（Than et al.， 2008）。用蔡司光學顯微鏡（Axio Lab A1，德國）觀察分生孢子形態(tài)，測量分生孢子大小，圖像由蔡司數(shù)碼相機（Axiocam Erc5s，德國）拍攝，用ZEN Lite 2012處理數(shù)據(jù)。

1. 2. 4 病原菌分子鑒定

1. 2. 4. 1 病原菌基因組DNA提取 從PDA培養(yǎng)基上刮取培養(yǎng)6 d左右的病原菌菌絲體10 mg，放入滅菌研缽中，加入液氮研磨成粉。采用基因組提取試劑盒（PlantGen DNA Kit，北京康為世紀生物科技有限公司），按操作指南提取病原菌基因組總DNA。

1. 2. 4. 2 病原菌rDNA-ITS和β-微管蛋白基因（β-tubulin）的PCR擴增 以提取的病原真菌基因組DNA為模板，用真菌特異引物對ITS1/ITS4和Bt2A/ Bt2B（Glass and Donaldson， 1995）分別擴增rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS，internal transcribed spacer）和β-tubulin基因的部分序列。PCR反應體系（25.00 μL）：10×Buffer 2.5 μL，10 μmol/L引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，模板DNA 0.5 ng，0.5 U Taq酶 0.2 μL，用ddH2O補足至25.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；10 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，記錄觀察結果。PCR擴增產(chǎn)物的純化采用康為凝膠純化試劑盒，具體操作見說明書。將純化后的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測序，利用NCBI在線軟件BLASTn將獲得的基因序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1. 2. 5 病原菌rDNA-ITS和β-tubulin系統(tǒng)發(fā)育分析 將獲得的病原菌rDNA-ITS和β-tubulin序列提交GenBank，用BLAST軟件搜索GenBank中相關rDNA-ITS和β-tubulin序列，同源性分析所選擇的比對菌株均屬于產(chǎn)生彎形分生孢子的炭疽菌屬真菌（Damm et al.， 2009），通過手工校正使序列排序獲得優(yōu)化，將校正后各個基因按照首尾相連方法合并，采用ClustalX 2.0 將選擇的序列進行多重比對分析，以Colletotrichum lindemuthianum（CBS 151.28）為外類群，通過MEGA 6.0構建NJ系統(tǒng)發(fā)育進化樹，自舉法檢測為500次重復。

2 結果與分析

2. 1 辣木果莢腐病田間危害癥狀及病原菌分離

辣木果莢腐病多發(fā)生于雨水集中期。越接近地面的果莢受害越重，果莢尖端的感病率高于近果柄部。病害發(fā)生時，最初在果莢上形成許多淡褐色、棕褐色的塊狀、條狀或不規(guī)則病斑（圖1-A），高溫、高濕條件下病斑迅速向四周擴張，果莢上的塊狀病斑連接起來后導致果莢棕褐色壞死，切開感病部位，受害部果肉為污褐色壞死，病健交界明顯。在連續(xù)降雨天，果莢感病部位出現(xiàn)條狀開裂，嚴重時整條果莢裂開，露出種仁。若天氣轉(zhuǎn)晴且濕度小時，受害果莢干腐、開裂，在受害部可見黑色小顆粒狀物的病原菌子實體（圖1-B）。

用組織分離法從辣木果莢腐病病組織中分離到26株分離物，根據(jù)菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，初步確定有一種細菌和一種真菌，其中所分離真菌產(chǎn)生的孢子形態(tài)為香蕉形，與從帶黑色小顆粒病殘體的辣木果莢上挑取鏡檢的孢子相似，將分離得到的真菌菌株命名為LMgh1。

2. 2 致病性測定結果

接種孢子為香蕉形真菌的果莢接種4 d后果莢表面形成褐色壞死，隨后病斑逐漸擴展，產(chǎn)生條狀裂口，癥狀與田間發(fā)病植株癥狀一致（圖2-A，圖2-B），7 d后從感病組織中再次分離得到同一種病原菌，而接種純PDA瓊脂塊和細菌的辣木果莢未出現(xiàn)癥狀（圖2-C， 圖2-D），經(jīng)柯赫氏法則確認這種能產(chǎn)生新月形孢子的真菌為致病菌。

2. 3 病原菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，（25±1）℃、光照與黑暗各12 h交替條件下培養(yǎng)，菌落初為白色，近圓形、平鋪、邊緣光滑、幾乎無氣生菌絲，培養(yǎng)3 d后在接種點周圍出現(xiàn)許多黑色、細小顆粒狀物，呈同心輪分布，后期整個菌落上均長出黑色、小顆粒狀物，整個菌落呈灰黑色，有少許氣生菌絲（圖3-C）。

該菌厚垣孢子呈球形，單生或串生于菌絲頂端或中間（圖3-A）；分生孢子單胞無色，新月形或鐮刀形，孢子頂端呈尖錐形彎曲、基部平截，具油滴，分生孢子大小為15.7～22.1 μm×2.5～4.3 μm（n=100）（圖3-B）。參考相關文獻（Damm et al.， 2009； Yang et al.， 2012）發(fā)現(xiàn)，病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與蘭生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）相似（圖3）。

2. 4 病原菌rDNA-ITS和β-tubulin比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

提取代表菌株LMgh1基因組DNA，用真菌的通用引物ITS1與ITS4擴增該病原菌18S rDNA部分序列、ITS1-5.8S-ITS2全部序列和28S rDNA部分序列片段，序列提交GenBank（登錄號：KT207464）。通過BLAST序列比對分析，該核酸序列與C. chlorophyti的相似性高達99%（登錄號：GU227894）。用Bt 2A/Bt 2B引物擴增獲得β-tubulin基因的部分序列（TUB2登錄號：KT862846），該序列樣與C. chlorophyti的β-tubulin基因序列（TUB2登錄號：GU228188）相似性達99%。

用于系統(tǒng)進化樹分析的炭疽菌株及其rDNA-ITS和β-tubulin基因序列參照Damm等（2009）的研究結果（表1）。基于rDNA-ITS和β-tubulin基因序列構建的炭疽菌系統(tǒng)進化樹見圖4，8個菌株共形成3個明顯分支，遺傳關系非常清晰。辣木果莢腐病病菌與其他不同來源2個C. chlorophyti模式菌株聚在一起，與其他種炭疽菌形成明顯分支。rDNA-ITS和β-tubulin比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結果進一步證明該病病原菌為C. chlorophyti。

3 討論

本研究將分離自帶黑色小顆粒狀物辣木病果莢的炭疽菌鑒定為蘭生炭疽菌（C. chlorophyti）。炭疽菌屬是一類世界性分布的植物病原菌，在高溫、高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)生危害最重，給許多林木、蔬菜、果樹、花卉及大田作物等造成嚴重的經(jīng)濟損失（Hyde et al.， 2009）。2012年美國科學家報道C. chlorophyti是引起大豆炭疽病的病原菌之一，此外該病原菌還能侵染柱花草、吊蘭等（Yang et al.， 2012）。

傳統(tǒng)炭疽菌的種類鑒定標準是根據(jù)分生孢子、菌落形態(tài)、菌絲生長速率、厚垣孢子和產(chǎn)生色素等特征進行確定（Smith and Black， 1990），但由于炭疽菌中許多種的分生孢子等形態(tài)相似，單用形態(tài)學特征很難準確鑒定其種類。ITS是指真核生物中rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是rDNA上的一個非編碼區(qū)域，包括ITS1和ITS2，該區(qū)域受外界環(huán)境的影響較小，與編碼區(qū)相比具有進化快的特點。真菌的ITS具有屬內(nèi)種間差異明顯、種內(nèi)較一致的特點，且基于rDNA-ITS的序列分析可以從核酸序列中獲得信息以反映生物親緣關系遠近及分類，目前已廣泛應用于真菌屬種間及部分種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學研究（Bruns et al.， 1991）。ITS序列分析已被用于解決炭疽菌和鐮刀菌種屬分類上的疑難問題（Photita et al.， 2005）。除了rDNA，β-tubulin序列分析已應用于真菌間的系統(tǒng)發(fā)育中（Bogale et al.， 2006）。本研究將傳統(tǒng)的植物病理學方法與現(xiàn)代分子生物學技術相結合，證實C. chlorophyti能為害辣木果莢引起果莢腐爛病。

鐮刀菌中的F. oxysporum、F. semitectum和F. solani已被報道為害辣木果莢、幼苗莖干（Pande and Ghate， 1998； Lezcano et al.， 2014），但目前尚未見炭疽菌侵染引起辣木果莢腐爛的相關研究報道，本研究首次報道C. chlorophyti為辣木果腐病致病菌。本研究取單個病斑病健交界處組織進行分離培養(yǎng)，從帶黑色顆粒狀物的病果莢中未同時分離到C. chlorophyti和已報道、能侵染辣木果莢的其他病原菌，這些病原菌是否存在協(xié)同侵染有待進一步驗證。前期研究中發(fā)現(xiàn)C. chlorophyti除了為害果莢外，還可侵染辣木葉和莖桿。當前辣木已推廣種植到高寒山區(qū)、干熱河谷及熱帶雨林等地，因此推測除現(xiàn)已報道的病原菌外，可能還存在其他的致病菌。

在云南西雙版納，辣木一年四季均可開花，吐蕾到謝花約30 d，坐果至成熟約95 d，從吐蕾到成熟約125 d（劉昌芬，2013）。西雙版納地區(qū)1～3月期間因降雨量少、天氣干旱、空氣濕度小等，辣木開空花，不結果；3月后的開花坐果率逐漸增加，6～8月為西雙版納地區(qū)降雨密集期，一旦天晴氣溫高達40 ℃左右，高溫高濕、驟冷驟熱不利于果莢生長，有利于病害暴發(fā)，加之雨水密集很難用化學農(nóng)藥防治，使病害加重。建議生產(chǎn)上在旱季的2月底加強灌溉及施肥，以促進辣木開花、坐果；在果莢生長到直徑0.8 cm左右時進行套袋，可有效防治辣木果莢腐病，同時還能預防害蟲為害果莢。防治辣木果莢腐病長久之計是選育抗病品種，栽培高產(chǎn)、抗病品種是經(jīng)濟、安全、綠色、環(huán)境友好的一種防病措施。因此，當前應加強現(xiàn)有栽培品種自然雜交后代抗病性評價，并加強培育高產(chǎn)抗病品種。

4 結論

本研究結果表明，腐爛辣木果莢中黑色小顆粒病殘體是蘭生炭疽菌（C. chlorophyti）侵害辣木果莢形成，蘭生炭疽菌是為害辣木果莢的致病菌。

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（責任編輯 麻小燕）