葡萄樹傷流液培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌的研究

伊力哈木·托合迪，呂　樂，劉　玲，艾爾肯·依不拉音*

(1.新疆和田師范?？茖W(xué)校生物化學(xué)系，和田 848000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

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葡萄樹傷流液培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌的研究

伊力哈木·托合迪1，呂樂2，劉玲2，艾爾肯·依不拉音2*

(1.新疆和田師范?？茖W(xué)校生物化學(xué)系，和田 848000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

摘要：目的確定葡萄樹傷流液作為乳酸菌培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌的適宜性。方法將葡萄樹傷流液作為乳酸菌培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌，并對所培養(yǎng)的乳酸菌的產(chǎn)酸能力、生長特點和情況進(jìn)行了初步研究。結(jié)果葡萄樹傷流液含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，適宜作為乳酸菌的培養(yǎng)基，pH值為4.75時乳酸菌的生長情況優(yōu)于pH值為4.48。葡萄樹傷流液含有產(chǎn)酸能力強、耐酸、耐高溫低溫和穩(wěn)定性高的乳酸菌。結(jié)論葡萄樹傷流液營養(yǎng)豐富，作為乳酸菌培養(yǎng)基是適宜的，對傷流液中乳酸菌的培養(yǎng)可以提高體系的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：葡萄樹傷流液；乳酸菌；穩(wěn)定性

葡萄樹傷流液是春季葡萄樹處在發(fā)芽時間段從葡萄樹植株的傷口處自然流出的無色、無味的純凈液體，其流量與葡萄樹品種等因素有關(guān)[1]。研究結(jié)果顯示，葡萄樹傷流液具有很強的抗氧化性能，其抗氧化性可耐高溫[2]。葡萄樹傷流液抗氧化性的強弱與葡萄樹的品種、產(chǎn)地等因素有關(guān)[3]。葡萄樹傷流液含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，有17種游離的氨基酸、蛋白質(zhì)以及多種礦物質(zhì)[4-6]。這些營養(yǎng)物質(zhì)為微生物的生長提供了豐富的營養(yǎng)。在一般條件下，葡萄樹傷流液會在微生物的作用下很快發(fā)生變質(zhì)。采用加熱滅菌方法可以提高葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性，但加熱處理后仍有微生物活動存在，加熱后40 d發(fā)生明顯的變質(zhì)現(xiàn)象[7]。而向葡萄樹傷流液中添加沙棗樹膠制備出的混合液具有很強的抑菌、滅菌性能[8]。一般沿著葡萄樹流出的葡萄樹傷流液中有多種微生物，這些微生物是影響葡萄樹傷流液穩(wěn)定性的主要因素，其中存在著有害菌和有益菌。在一定條件下，耐酸、耐高溫的植物乳酸菌可以成為葡萄樹傷流液中的優(yōu)勢菌。在葡萄樹傷流液中培養(yǎng)乳酸菌能增強葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性。在一些有害菌的作用下，葡萄樹傷流液很容易氧化變質(zhì)，乳酸菌是生產(chǎn)乳酸和生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的有益菌群，其中的植物乳酸菌是耐熱菌種，生命力更強。添加有利于乳酸菌生長的物質(zhì)，為乳酸菌成為優(yōu)勢菌創(chuàng)造條件，可以通過培養(yǎng)乳酸菌除去不利的微生物[9]。當(dāng)葡萄樹傷流液中的乳酸菌成為優(yōu)勢菌后，在乳酸菌生長過程中不斷產(chǎn)生乳酸，所產(chǎn)乳酸的量足以使培養(yǎng)基pH值下降到葡萄樹傷流液中蛋白質(zhì)的等電點時，葡萄樹傷流液中的蛋白質(zhì)會沉淀出來，提高葡萄樹傷流液的黏度[10]。此時可以制作出純?nèi)榘咨⒕哂休^高黏度和穩(wěn)定性高的純天然葡萄樹傷流液的植物乳酸菌產(chǎn)品。但對葡萄樹傷流液研究時間短，特別是對葡萄樹傷流液中所生長的微生物的性能還沒有進(jìn)行系統(tǒng)地研究，未能有效地解決葡萄樹傷流液的變質(zhì)等問題。本文介紹了向葡萄樹傷流液中添加具有特定作用的物質(zhì)使傷流液中的乳酸菌成為優(yōu)勢菌，利用葡萄樹傷流液配制乳酸菌培養(yǎng)基的方法，對葡萄樹傷流液培養(yǎng)基中乳酸菌的耐酸、耐高溫、耐冷和發(fā)酵類型等性質(zhì)進(jìn)行研究。

1儀器與材料

1.1儀器SW-CS-F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海秣馬恒溫設(shè)備廠；AEL-160型電子分析天平，日本島津公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計，雷磁分析儀器廠；橡皮筋，報紙，記號筆。

1.2材料葡萄樹傷流液的收集：2013年4月上旬，在新疆和田市3年齡紅葡萄園，剪去幾根1年生枝條，用純凈水將葡萄樹枝條洗凈后，將枝條端插入到保鮮袋中，將其捆緊封閉，避免與空氣直接接觸。接收葡萄樹傷流液，過濾后注入到塑料瓶中至滿，密封，置于4 ℃冰箱中備用。

2方法

2.1葡萄樹樹膠的提取將剪下的葡萄樹上生長3年的枝條，剝?nèi)⊥馄ぃ舫? cm左右的枝條稱取適量，用純凈水洗凈，浸泡在純凈水中，72 h后，枝條上有白色樹膠溢出，攪拌1 h左右使其溶解，撈取枝條，液體過濾得到微帶乳白色的溶液。將此溶液放在恒溫水浴鍋中50 ℃恒溫加熱蒸發(fā)，得到乳白色片狀的葡萄樹樹膠，置于4 ℃冰箱中備用。

2.2葡萄樹傷流液培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌

2.2.1葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基的配制(1)以高溫高壓處理葡萄樹傷流液配制乳酸菌培養(yǎng)基。將貯存在冰箱中的葡萄樹傷流液注入到121 ℃高壓鍋中，加熱5 min，停止加熱，冷卻至室溫后加入葡萄樹樹膠，使其在傷流液中的量達(dá)到5%。不斷攪拌使葡萄樹樹膠溶解，生成均勻透明的溶液，向此溶液中添加適量檸檬酸使其pH值為4.48，為葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基1。(2)在常溫常壓下葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基的配制。將貯存在冰箱中的葡萄樹傷流液放置在室溫，溫度為20 ℃，加入葡萄樹樹膠，使其在傷流液中的量達(dá)到5%。不斷攪拌使葡萄樹樹膠溶解，生成均勻透明的溶液，向該溶液中加入適量的檸檬酸使其pH值為4.75，為葡萄樹傷流液的乳酸菌培養(yǎng)基2。

2.2.2在葡萄樹傷流液培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳酸菌將葡萄樹傷流液的乳酸菌培養(yǎng)基1和2分別置于4，25和40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)乳酸菌。測定其在不同培養(yǎng)時間，各培養(yǎng)基pH值的變化情況。同時用紫外分光光度計在620 nm處，測量其不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)基折光率的變化情況。

3結(jié)果

3.1葡萄樹傷流液的一般理化特征新鮮的葡萄樹傷流液是春季從葡萄樹傷口自然流出的無色透明液體，新鮮純凈的葡萄樹傷流液無色、無味。葡萄樹傷流液的天然pH值為4.8～5.5。隨著放置時間的延長，傷流液由無色透明轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，出現(xiàn)一定的異味，并產(chǎn)生出一定的絮狀物質(zhì)，pH值也逐漸上升，4 ℃下密封貯存1年的的葡萄樹傷流液的pH值為6.40～6.95。每100 mL 葡萄樹傷流液原液經(jīng)冷凍干燥，可得白色晶狀的干燥物質(zhì)56 mg。

3.2葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基的pH值變化在不同的溫度下，測定葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基1的pH值變化，結(jié)果見表1。

表1葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基1的pH值變化

Tab.1 The pH changes of grape bleeding sap culture medium 1

溫度/℃不同時間(d)的pH值024567910131622283440465244.464.384.354.343.823.603.513.473.423.383.343.323.313.303.303.28254.464.383.933.463.213.203.083.022.912.822.662.642.632.612.612.59404.464.404.384.344.294.244.204.164.094.053.993.923.873.823.793.76

由表1可知，高溫加熱葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)液分別置于溫度為4，25和40 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的pH值在不斷地降低，培養(yǎng)液一直保持均勻穩(wěn)定的狀態(tài)。在溫度為25 ℃時，乳酸菌的產(chǎn)酸速度最快，培養(yǎng)基1中乳酸菌在此溫度時產(chǎn)酸能力最強，其次是4 ℃，在40 ℃時培養(yǎng)液的pH值的變化最慢。實驗結(jié)果表明，葡萄樹傷流液中有耐高溫的乳酸菌，加適量酸和高溫加熱滅菌，除去有害菌后可為乳酸菌的生長創(chuàng)造有利條件。從溫度對葡萄樹傷流液中的乳酸菌產(chǎn)酸的影響來觀察，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中存在耐冷和耐熱乳酸菌，在較低溫度4 ℃下能產(chǎn)酸，在40 ℃時也能產(chǎn)酸。因此，在4 ℃時葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中耐冷乳酸菌為優(yōu)勢菌，乳酸菌作為有益菌通過乳酸和抑菌性物質(zhì)的產(chǎn)生會增強培養(yǎng)液的穩(wěn)定性。而處于40 ℃時葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1的酸度的變化最慢，穩(wěn)定性最高，50 d后其pH值為3.76。從葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中的乳酸菌產(chǎn)乳酸情況觀察，葡萄樹傷流液存在的乳酸菌種類多，即含有耐高溫、耐酸、耐冷乳酸菌。葡萄樹傷流液中乳酸菌的適應(yīng)性很強，25 ℃時葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中優(yōu)勢菌是耐冷乳酸菌。從酸性的變化幅度可以看出，常溫產(chǎn)酸速度較慢，為了達(dá)到最小的pH值需要較長的時間，說明葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1在一般條件下具有較好的穩(wěn)定性。利用此方法可以培養(yǎng)耐熱、耐酸的乳酸菌，生產(chǎn)乳酸使其產(chǎn)生抑菌性物質(zhì)來提高葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性。利用此方法可以為葡萄樹傷流液的開發(fā)利用創(chuàng)造條件。

在不同的溫度下，測定葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基2的pH值變化，結(jié)果見表2。

表2葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基2的pH值變化

Tab.2 The pH changes of grape bleeding sap culture medium 2

溫度/℃不同時間(d)的pH值024567910131622283440465244.754.703.823.803.783.683.623.363.353.343.142.932.832.772.752.74254.754.673.823.483.223.163.103.063.022.852.652.582.262.101.941.94404.754.723.903.753.573.493.423.343.283.193.162.912.762.612.562.45

由表2可知，在相同的溫度下，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2的pH值降低幅度比葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1的降低幅度大。由此說明，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2中的乳酸菌的活性比葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1乳酸菌的活性高。溫度對葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2的pH值的影響與培養(yǎng)基1是相同的，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2的優(yōu)勢菌同樣是耐冷乳酸菌。所配制的葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2中所生長的乳酸菌適應(yīng)低溫能力較強，這可能是由于葡萄樹處在野外，溫度較低，其樹枝含有的菌種群適應(yīng)低溫所致。在室溫25 ℃時葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2最終達(dá)到的最低pH值更小(相當(dāng)于濃度為1 mol·L-1的乳酸菌的pH值為1.94)，說明其中乳酸菌的產(chǎn)酸能力和耐酸性更強。所生產(chǎn)乳酸的純度較高，乳酸菌的發(fā)酵類型是同型發(fā)酵，利用本培養(yǎng)基可以生產(chǎn)純度較高的乳酸。但葡萄樹傷流液培養(yǎng)基2的穩(wěn)定性比葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1的穩(wěn)定性弱，培養(yǎng)基的衰亡速度較快。說明高溫加熱滅菌處理對葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性是有利的。

3.3葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基中的乳酸菌生長情況不同的溫度下，葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基1中的乳酸菌生長情況，見表3。

表3葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基1的乳酸菌生長情況

Tab.3 The lactic acid bacteria growth condition of grape bleeding sap culture medium 1

溫度/℃不同時間(d)的折光率024567910131622283440465240.0380.0750.1180.1320.1680.1920.2040.2220.2390.2580.2750.2960.3160.3410.3670.394250.0380.3660.3800.3850.3950.4050.4130.4180.4250.4350.4530.4110.3550.2930.2660.209400.0380.0620.0780.0920.1080.1250.1470.1550.1470.1360.1310.1270.1190.1120.1070.099

由表3可知，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1在25 ℃時，乳酸菌生長的延遲期和對數(shù)期都較短，培養(yǎng)基配制后乳酸菌就開始生長，其生長很快就進(jìn)入對數(shù)期，且在48 h內(nèi)就完成乳酸菌生長的對數(shù)期。25 ℃時，在葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中乳酸菌生長的穩(wěn)定期和衰亡期都較長，為20 d。說明葡萄樹傷流液培養(yǎng)基是較穩(wěn)定的體系。葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1達(dá)到生長穩(wěn)定期時乳酸菌的數(shù)量較少，但是衰亡期和穩(wěn)定期都較長，穩(wěn)定性更強。說明高溫加熱處理葡萄樹傷流液時，葡萄樹傷流液中菌種及營養(yǎng)物質(zhì)的部分消耗使乳酸菌的數(shù)量和生長受到了影響，同時加熱除去更多的有害菌，提高了培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。4 ℃時，培養(yǎng)基1中乳酸菌的生長速度明顯變慢。溫度高于40 ℃時，不利于葡萄樹傷流液中乳酸菌的生長。由此說明，葡萄樹傷流液培養(yǎng)基1中乳酸菌是以耐冷菌為主，其最高生長溫度低于40 ℃。但是，高溫處理葡萄樹傷流液后乳酸菌在室溫或較高的溫度下生長和衰亡速度都慢，而穩(wěn)定性較高，可以利用此方法提高葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性。

不同的溫度下，葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基2中的乳酸菌生長情況，見表4。

表4葡萄樹傷流液乳酸菌培養(yǎng)基2的乳酸菌生長情況

Tab.4 The lactic acid bacteria growth condition of grape bleeding sap culture medium 2

溫度/℃不同時間(d)的折光率024567910131622283440465240.0280.0850.1180.3100.4700.4920.5030.5140.5310.5580.5980.5860.2160.1310.0970.077250.0280.2090.4290.4750.5190.5500.5650.5680.5750.5920.6840.6120.5950.3330.2980.015400.0280.0460.0990.1030.1250.1320.1370.1250.1120.0860.0620.0410.0340.0250.0190.016

由表4可知，培養(yǎng)基2中乳酸菌生長延遲期比培養(yǎng)基1長，生長的對數(shù)期較短，達(dá)到最高菌數(shù)所需要的時間相同，而培養(yǎng)基2中乳酸菌衰亡期更短。說明培養(yǎng)基2的穩(wěn)定性低于培養(yǎng)基1的穩(wěn)定性，由此說明，加熱處理可以提高葡萄樹傷流液的穩(wěn)定性。比較表3和表4中乳酸菌數(shù)量的最高值可以看出，培養(yǎng)基2中乳酸菌的數(shù)量高于培養(yǎng)基1中乳酸菌的數(shù)量，說明加熱處理使傷流液中營養(yǎng)物質(zhì)和乳酸菌的數(shù)量減少，培養(yǎng)基中乳酸菌的數(shù)量會受到影響。從溫度對培養(yǎng)基1和2中乳酸菌生長的影響來看，在低溫培養(yǎng)基2中的生長更快，顯示菌數(shù)量、菌品種更多。說明沒有加熱時傷流液中乳酸菌在低溫環(huán)境中生長更快，葡萄樹傷流液中的乳酸菌更適宜在低溫環(huán)境中生長，但其穩(wěn)定性較弱。

4討論

乳酸菌被認(rèn)為是GRAS(Generally recognized as safe)類細(xì)菌，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)。在飼料[11]、食品[12]、飲品[13]等中作為添加組分，有促進(jìn)生長發(fā)育、抗菌等作用。葡萄樹傷流液中的營養(yǎng)物質(zhì)及其抗氧化性為厭氧乳酸菌的生長創(chuàng)造了良好的環(huán)境。葡萄樹傷流液培養(yǎng)基中的乳酸菌耐酸、耐高溫、耐低溫，也可以在室溫下生長。說明葡萄樹傷流液中可以生長種群多的乳酸菌，且適應(yīng)性很強。因此，葡萄樹傷流液中的乳酸菌在一定條件下很容易成為優(yōu)勢菌群，這就為葡萄樹傷流液及其中乳酸菌的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the lactic acid bacteria cultured by grapevine bleeding sap medium

Ilham TOHTI1，Lü Le2，LIU Ling2，Arkin IBURAIM2*

(1.Department of Biochemistry，Hotan Teachers College，Hotan 848000，China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the suitability of grapevine bleeding sap as a medium for culturing lactic acid bacteria. MethodsGrape bleeding sap was used as a medium of lactic acid bacteria. Then the ability of producing acid，growth characteristics and conditions were assessed. ResultsGrapevine bleeding sap contained rich nutrients. And it was suitable as a culture medium of lactic acid bacteria. At pH 4.75，the growth condition of lactic acid bacteria was better than at pH 4.48. Grapevine bleeding sap contained lactic acid bacteria，which had the ability to produce acid，good thermostability and high stability. The major lactic acid bacteria was the low cold bacteria. ConclusionGrapevine bleeding sap contained abundant nutritions. It was suitable to be used as a medium to culture lactic acid bacteria. And the stability of the grapevine bleeding sap could be improved in this way.

Key words:grapevine bleeding sap；lactic acid bacteria；stability

(收稿日期：2015-09-26)

中圖分類號：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0288-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.020

*通信作者：艾爾肯·依不拉音，男，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡介：伊力哈木·托合迪，男，副教授

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(編號:21162030)