丹參素靶向乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抗乙肝及抗原表達(dá)影響機制研究

段樹鵬　朱利紅　李鵬　宋新文　王宏偉　申保生

[摘要]該文采用MTT法測定丹參素對轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株（HepG2）的2215細(xì)胞活性的抑制作用，通過間接熒光標(biāo)記法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化；采用ELISA法測定細(xì)胞上清乙肝表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）水平，采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA水平；利用酶抑制動力學(xué)方法，研究了丹參素對HBV RT的抑制作用；最后利用圓二色譜法監(jiān)測丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示丹參素能夠?qū)epG2215細(xì)胞的生長起到良好的抑制作用，半抑制濃度IC50為（1535±243） μmol·L-1；丹參素能顯著抑制HBsAg和HBeAg表達(dá)，同時對HBV DNA復(fù)制具有抑制作用；此外，丹參素是一種有效的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[半抑制濃度IC50為（2132±243）μmol·L-1]，熒光標(biāo)記法檢測，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨著丹參素呈濃度依賴性升高；圓二色譜分析表明丹參素誘導(dǎo)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的構(gòu)象發(fā)生部分改變，α螺旋含量逐漸增加。結(jié)果表明丹參素能夠通過結(jié)合HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)變得緊密，而不利于活性中心的形成，最終使HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性降低。而這種誘導(dǎo)酶的活性降低直接影響到乙肝病毒DNA的復(fù)制，加之抗原水平的降低，增加了丹參素抗乙肝病毒的藥效。

[關(guān)鍵詞]丹參素；HepG2215細(xì)胞；乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶；活性氧；二級結(jié)構(gòu)；抑制作用

[Abstract]MTT assay was used in this study to investigate the inhibitory effect of danshensu on the activity of 2215 cells among human hepatoma cell line （HepG2）； indirect fluorescence labeling method was used to measure the changes of reactive oxygen levels in the cells； ELISA method was used to determine hepatitis B surface antigen （HBsAg） and hepatitis B e antigen （HBeAg） levels in cellular supernatants； HBV DNA level was measured with fluorogenic quantitative PCR method The inhibitory effect of danshensu on HBV RT（hepatitis B virus reverse transcriptase） was studied by using enzyme inhibition dynamics， and the effect of danshensu on secondary structure of HBV reverse transcriptase was monitored by using circular dichroism The results showed that danshensu had a good inhibitory effect on the growth of HepG2215 cells， with a half inhibitory concentration （IC50） of （1535±243） μmol·L-1； danshensu could significantly inhibit HBsAg and HBeAg expressions， and showed an inhibitory effect on HBV DNA replication In addition， danshensu was an effective inhibitor for HBV reverse transcriptase [IC50 （2132±243） μmol·L-1] The fluorescence labeling results showed that the reactive oxygen levels in the cells were increased with the increase of danshensu concentration Circular dichroism analysis showed that danshensu could induce partial change of conformation of HBV reverse transcriptase and gradually increased αhelical content These results indicated that danshensu could make the structure of the enzyme become closer by binding to HBV reverse transcriptase， which was not conducive to the formation of the active center， so it could finally decrease the activity of HBV reverse transcriptase Such decrease in enzyme activity would directly affect the HBV DNA replication， and combined with the decrease of the antigen levels， the effect of danshensu on HBV was increased

[Key words]danshensu； HepG2215 cells； reverse transcripatase of HBV； reactive oxygen species； secondary structure； inhibitory effect

doi：10.4268/cjcmm20160722

丹參素（danshensu）屬于酚性芳香酸類化合物，大量存在于丹參類植物中；丹參素有多種藥理活性[12]，對心肌缺血的保護作用，抑制血小板聚集及抗凝作用，對動脈粥樣硬化的拮抗作用及降血脂作用，抗菌消炎及增強機體免疫作用和抗腫瘤作用，而其中其對肝臟的保護作用在近年來受到廣泛關(guān)注，蔣莉等[3]研究發(fā)現(xiàn)丹參素能夠?qū)?nèi)毒素引起的肝損傷起到良好的保護作用；鄭元義等[4]發(fā)現(xiàn)丹參素能夠?qū)γ庖咝愿卫w維化有明顯的抑制效果。大量研究表明慢性乙型肝炎（HBV）所引起的感染，能夠?qū)е赂斡不透伟┑陌l(fā)生，因此乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶在病毒復(fù)制中具有十分重要的作用，可作為研究抗病毒藥物丹參素的重要靶點[5]，為丹參素在乙肝病毒治療領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

11細(xì)胞株乙型肝炎病毒（HBV）DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株（HepG2）的2215細(xì)胞 （中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會細(xì)胞庫），在本實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。

12儀器與試劑丹參素（分析對照品，20 mg）購自Sigmaaldrich（上海）貿(mào)易有限公司；拉米夫定（01 g/片）購自CiplaLtd公司，批號G25193；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué) （北京）有限公司；優(yōu)級肽牛/小牛血清購自澳大利亞 PAA 公司；CaspaseGlooR3檢測試劑盒購自Sigmaaldrich（上海）貿(mào)易有限公司；胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，5×103 mg·L-1，PBS配制）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。酶標(biāo)儀SpectraMax Plus384購自美谷分子公司；生物安全柜，型號HR40ⅡA2 Haier，購自青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；pHS3C型酸度計購自上海雷磁儀器廠；BioRad680型酶聯(lián)檢測儀，MOS 450型圓二色譜儀購自法國BioLogic公司；GWAUN2超純水儀購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；流式細(xì)胞儀（FACSAria）購自美國Becton Dikinson公司。

13細(xì)胞活性檢測[6]將對數(shù)生長期HepG2215細(xì)胞以 1×105個/孔接種于96孔板，200 μL/孔，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的丹參素和拉米夫定培養(yǎng)基，每個藥物3個平行孔。分別培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，用振蕩器充分振蕩，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔在 570 nm處的吸光度（A）。根據(jù)A計算，細(xì)胞活性=A實驗組/A對照組×100%。

14流式細(xì)胞儀檢測HepG2215細(xì)胞內(nèi)ROS[7]將對數(shù)生長期HepG2215細(xì)胞以1×105個/孔接種于96孔板中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入5，10，25，50，100 μmol·L-1的丹參素和拉米夫定（10 μmol·L-1）培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照，每個藥物3個平行孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用PBS重新懸浮細(xì)胞，首先加入5 μL的FITCAnnexin V避光染色5 min，然后再加入10 μL的PI避光染色15 min，在室溫下避光孵育15 min。取樣后，加入到流式細(xì)胞儀，進(jìn)行熒光強度檢測。

15丹參素體外抗HBV作用[8]以轉(zhuǎn)染HBV基因的HepG2215細(xì)胞為模型，對丹參素的抗HBV作用進(jìn)行評價，評價指標(biāo)為細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg，HBeAg，HBV DNA含量。將HepG2215細(xì)胞用胰蛋白酶EDTA消化并稀釋成50×104個/mL，接種200 μL于96 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后傾去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的丹參素（5，10，25，50，100 μmol·L-1）和拉米夫定（10 μmol·L-1），同時設(shè)空白對照。提取培養(yǎng)上清，用ELISA試劑450 nm處測定培養(yǎng)基中HBsAg和HBeAg吸光度，抑制率=（A空白組-A抑制劑）/A空白組×100%。并用HBV DNA定量PCR試劑測定培養(yǎng)基中HBV DNA濃度。

16HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測參照王晨吟等[9]方法，將丹參素和拉米夫定100 μL加入到96 孔培養(yǎng)板中，并加入20 μL含逆轉(zhuǎn)錄酶的PBS溶液、70 μL的 RT Buffer，在37 ℃水浴1 h后，用洗液清洗3次，除去未結(jié)合的游離底物，再向每孔中加入100 μL BSA （1%） 溶液，在室溫下進(jìn)行30 min的封閉，之后洗板，并再向每孔中加入50 μL的SAALP稀釋液，在37 ℃水浴 1 h后洗板，最后向每孔中加入底物 PNPP（1 g·L-1）50 μL。在405 nm波長下，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定A，計算酶的抑制率=（A空白對照孔-A實驗孔）/ A空白對照孔×100%。

17圓二色光譜的測定將不同濃度的丹參素加入到HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的溶液中，混合均勻，以pH 75的磷酸鹽（50 mmol·L-1） 緩沖液做空白，測定樣品在37 ℃下的CD光譜。

18統(tǒng)計學(xué)分析本文采用SPSS 180統(tǒng)計軟件對各組中HepG2215細(xì)胞活性、HBV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制率和體外抗HBV作用以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<005具有顯著差異性。

2結(jié)果與分析

21丹參素對HepG2215細(xì)胞生長的抑制作用解析丹參素和拉米夫定對HepG2215細(xì)胞生長的半抑制濃度IC50分別為（1535±243），（1165±201） μmol·L-1；丹參素對HepG2215細(xì)胞生長的抑制能力與拉米夫定相當(dāng)，無顯著性差異，見圖1。

22丹參素誘導(dǎo)HepG2215細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧水平結(jié)果見表1，丹參素能夠提高HepG2215細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，且呈濃度依賴性升高。加藥組與對照組比較，具有顯著性差異（P<005）。

23丹參素的體外抗HBV作用丹參素作用細(xì)胞1周后，在一定濃度范圍內(nèi)，都能夠顯著抑制HBsAg和HBeAg表達(dá)，其最高抑制率分別為5718%，6234%；同時在10，25，50，100 μmol·L-1濃度下對HBV DNA的合成具有明顯抑制作用，見表2。

24丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用見圖2，隨著丹參素濃度的增加，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性呈不斷下降的趨勢，直到丹參素的濃度達(dá)到100 μmol·L-1后，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的相對活性趨于平緩；解析其半數(shù)抑制濃度（IC50）為（2132±243） μmol·L-1，略高于陽性對照拉米夫定的IC50 （1644±189） μmol·L-1，顯示出丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶有良好的抑制效果。

25丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶二級結(jié)構(gòu)的影響應(yīng)用在線Dichroweb軟件計算出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶與丹參素結(jié)合前后的二級結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果見表3。從表中可以看出游離HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的α螺旋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為356%，β折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200%，是典型的α螺旋型蛋白類，當(dāng)向HBV逆轉(zhuǎn)錄酶中加入丹參素的濃度達(dá)到100 μmol·L-1時，α螺旋質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到485%，β折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小到89%，這表明丹參素會誘導(dǎo)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)象發(fā)生了部分變化。

3討論

乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，目前尚無根治的特效藥物和方法；眾所周知，逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)也叫反轉(zhuǎn)錄 （reverse transcription）。在這個過程中，遺傳信息流HBV逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)生，即催化脫氧核糖核苷酸以RNA為模板合成DNA，之后形成一代又一代的DNA，之后HBV雙鏈DNA進(jìn)行環(huán)化，最終完成HBVDNA的復(fù)制[9]，所以基于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用機制，筆者以HBV逆轉(zhuǎn)錄酶為作用靶點，進(jìn)行抗乙肝病毒藥物研發(fā)具有重要意義。

HepG2215細(xì)胞是將含有HBV基因組的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞[10]，經(jīng)G418篩選得到的克隆，該細(xì)胞能在體外長期培養(yǎng)，并能穩(wěn)定分泌HBsAg，HBeAg及Dane顆粒并產(chǎn)生cccDNA，是目前抗乙肝藥物體外評價最常用的模型[11]；ROS是由細(xì)胞內(nèi)氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的氧分子[12]。這些氧分子主要由超羥自由基（·OH）、氧陰離子自由基（O-·2）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（O2）等氧自由基組成[13]。這些氧分子能夠在機體內(nèi)與自身的消化達(dá)到動態(tài)平衡，一旦平衡被打破，ROS將促進(jìn)細(xì)胞的快速凋亡[1415]，本研究考察了不同濃度的丹參素對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)丹參素可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，進(jìn)而誘導(dǎo)了HepG2215細(xì)胞的凋亡。此外，研究表明，丹參素能夠促進(jìn)HepG2215細(xì)胞活性的降低，且能夠顯著的抑制HBsAg，HBeAg的表達(dá)和HBV DNA的復(fù)制。這意味著，丹參素在細(xì)胞水平對HBV抗原的表達(dá)和DNA的復(fù)制起到抑制作用。

藥物分子與蛋白的結(jié)合勢必會對蛋白的結(jié)構(gòu)造成影響，因此本研究應(yīng)用了圓二色譜技術(shù)，圓二色譜技術(shù)以其較高的靈敏度、較好的選擇性、較強的信號水平為酶（蛋白質(zhì)）的二級結(jié)構(gòu)測定提供了一條新的分析途徑。結(jié)果表明，丹參素能夠誘導(dǎo)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的α螺旋含量的增加，使HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)變得緊密而不利于酶形成活性中心，致使HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活力下降[16]，這可能是丹參素對HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制的機制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李驊，王四旺，張邦樂. 丹參素的藥理活性與藥物動力學(xué)研究進(jìn)展[J]. 西北藥學(xué)雜志，2011，26（4）： 310.

[2]王冰瑤，吳曉燕，樊官偉. 丹參素保護心血管系統(tǒng)的藥理作用機制研究進(jìn)展[J]. 中藥材，2014，45（17）： 2571.

[3]蔣莉，李躍華，戚曉紅，等.丹素對內(nèi)毒素性肝損傷的防護作用及其機制[J]. 西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，1999，9（2）： 30.

[4]鄭元義，戴立里，王文兵，等. 丹參素治療肝纖維化及其作用機制研究[J]. 中華肝臟病雜志，2003，11（5）： 288.

[5]黃正明，楊新波，曹文斌，等. 5種中藥提取物對鴨乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的抑制作用[J]. 人民軍醫(yī)藥學(xué)專刊，1997，13（2）： 71.

[6]Fabrizio A，Alice F. Liposomes and MTT cell viability assay： an incompatible affair[J]. Toxicol In Vitro，2015，29（2）： 314.

[7]劉欣，索智敏. 苦參抗乙肝病毒的作用機制研究[J]. 中國生化藥物雜志，2015，35（4）： 67.

[8]戴靈豪，沈鈺明，伍義行，等. 松果菊苷對乙肝病毒復(fù)制和抗原表達(dá)的影響[J]. 中國中藥雜志，2015，40（15）： 3047.

[9]張晨. 大黃酸聯(lián)合賀普丁對乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶影響[J]. 中國公共衛(wèi)生，2015，31（6）： 781.

[10]Seeger C， Mason W S. Hepatitis B virus biology[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2000， 64（1）： 51.

[11]Korba B E， Milman G. A cell culture assay for compounds which inhibit hepatitis B virus replication[J]. Antiviral Res， 1991， 15（3）： 217.

[12]劉儀，王凱，王介非. 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制[J]. 中華臨床感染病雜志，2008，1（3）： 123.

[13]Shoeb M， Khan J A， Khan W， et al. ROSdependent anticandidal activity of zinc oxide nanoparticles synthesized by using egg albumen as a biotemplate[J]. Advan Nat Sci Nanos Nano， 2013， 4（3）： 35015.

[14]Pan X， Zhang X， Sun H， et al. Autophagy inhibition promotes 5fluorouraciinduced apoptosis by stimulating ROS formation in human nonsmall cell lung cancer A549 cells[J]. PLoS ONE， 2013， 8（2）： 55674.

[15]Sepúlveda M， Gonano L A， Back T G， et al. Role of CaMKII and ROS in rapid pacinginduced apoptosis[J]. J Mol Cell Cardio， 2013， 63（1）： 135.

[16]Yan J K， Zhang G W， Pan J H， et al. αGlucosidase inhibition by luteolin： kinetics， interaction and molecular docking[J]. Int J Biol Macromol， 2014， 64（3）：213.

[責(zé)任編輯馬超一]