β蠶感撩訊訟β142誘導星形膠質(zhì)細胞活化所致PC12細胞損傷的保護作用研究

何瀠　何嘉娜　付俊　包玉婷　李昌煜　楊元宵

[摘要]該文探討β細辛醚對Aβ142誘導星形膠質(zhì)細胞活化所致PC12細胞損傷的保護作用及其機制，為β細辛醚在阿爾茲海默病（Alzheimers diease，AD）防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。首先，采用實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)（Real time cell analysis，RTCA）構(gòu)建RAh/PC12共培養(yǎng)體系，實時動態(tài)觀察Aβ142誘導星形膠質(zhì)細胞損傷后對共培養(yǎng)體系中PC12細胞存活率的影響，根據(jù)系統(tǒng)自動生成的存活率曲線和參數(shù)選出最佳的藥物干預時間，采用不同濃度的β細辛醚對星形膠質(zhì)細胞進行干預，觀察共培養(yǎng)體系中PC12細胞存活率的改變；其次，采用MTT法檢測Aβ142作用于RAh對PC12細胞存活率的影響以及β細辛醚的干預效應(yīng)，驗證RTCA的檢測結(jié)果；進一步采用ELISA法檢測下室培養(yǎng)液中IL1β，TNFα，BDNF的水平；Western blot法檢測PC12細胞NFκB的活性和ERK，p38，JNK磷酸化水平。結(jié)果顯示，β細辛醚（555 mg·L-1）能顯著減緩Aβ142誘導的RAh活化引起的PC12細胞存活率下降（P<001），顯著降低下室培養(yǎng)液中IL1β，TNFα的水平和PC12細胞ERK，p38，JNK磷酸化水平（P<001）；β細辛醚（1667 mg·L-1）能促進下室培養(yǎng)液中BDNF的釋放（P<005）。以上結(jié)果表明，Aβ142誘導RAh活化并釋放IL1β，TNFα等炎癥因子加劇PC12細胞的損傷；β細辛醚能降低IL1β，TNFα和促進BDNF的釋放，抑制PC12細胞NFκB的活性和ERK，p38，JNK磷酸化水平。

[關(guān)鍵詞]β細辛醚；Aβ142；星形膠質(zhì)細胞；PC12細胞；RTCA；NFκB

[Abstract]This study was aimed to investigate the protective effect and mechanism of βasarone on PC12 cells injury induced byAβ142 activated astrocytes， and provide experimental basis for βasarone application in the prevention and control of Alzheimer′s disease （AD） Firstly， RAh and PC12 cells were cocultured in the special transwell chamber， and the Real time cell analysis （RTCA） system was used to realtime observe its effect on PC12 cells survival rate in the coculture system after astrocytes injury induced by Aβ142. The best intervention time of βasarone was selected according to the survival curve and parameters generated automatically βasarone with different concentrations was used for intervention on astrocytes， then the changes of PC12 cells survival rate in the coculture system were observed Secondly， MTT assay was used to detect the effect of Aβ142 on PC12 cells survival rate as well as the intervention effect of βasarone， and verify the testing results of RTCA The levels of IL1β， TNFα and BDNF in culture media of the lower chamber were detected by ELISA The NFκB activity and phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK were detected by Western blot Results showed that βasarone （555 mg·L-1） could significantly slowdown the decline of PC12 cells survival rate caused by Aβ142induced RAh activation （P<001）， significantly reduce the levels of IL1β， TNFα and the phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK in culture media of the lower chamber （P<001） βasarone（1667 mg·L-1） could promote the release of BDNF in culture media of the lower chamber（P<005） These results indicated that Aβ142 could induce RAh activation and its release of IL1β， TNFα and other inflammatory factors to aggravate the PC12 cells injury； βasarone could reduce the levels of IL1β， TNFα， promote the release of BDNF， and inhibit the NFκB activity as well as phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK protein in PC12 cells

[Key words]βasarone； Aβ142； astrocyte； PC12 cell； RTCA； NFκB

doi：10.4268/cjcmm20160720

近年來研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的細胞群，與阿爾茲海默?。ˋlzheimer′s diease，AD）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AD早期可出現(xiàn)廣泛、持續(xù)的星形膠質(zhì)細胞激活[1]，其發(fā)展過程中腦內(nèi)始終存在著以星形膠質(zhì)細胞激活為特征的炎癥反應(yīng)。激活的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生并釋放大量炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，起初可進行自身保護，修復受損組織，保護神經(jīng)元，持續(xù)的炎癥反應(yīng)則加劇Aβ的生成，加速神經(jīng)元的損傷，誘發(fā)AD[2]。本實驗通過構(gòu)建星形膠質(zhì)細胞和PC12細胞的共培養(yǎng)體系作為研究對象，能很好地模擬腦內(nèi)微環(huán)境，較之于體外研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的單一細胞模型具有一定的優(yōu)勢。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根莖，具有開竅豁痰、醒神益智的功效，臨床上廣泛應(yīng)用于癲癇、健忘、耳鳴、中風失語、老年性癡呆等病癥[3]。β細辛醚為石菖蒲的主要有效成分，其對β淀粉樣蛋白誘導的PC12細胞凋亡具有抑制作用[45]，對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有一定的保護作用[67]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，β細辛醚對Aβ142誘導活化的星形膠質(zhì)細胞損傷有保護作用。但β細辛醚的作用與Aβ活化的星形膠質(zhì)細胞對PC12細胞的影響尚未見報道。本文在前期實驗的基礎(chǔ)上，研究β細辛醚對Aβ142誘導星形膠質(zhì)細胞活化所致PC12細胞損傷的保護作用，為β細辛醚在AD防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1材料

熒光倒置顯微鏡（德國萊卡公司，型號DMI3000B）；CO2培養(yǎng)箱，生物安全柜（德國Thermo公司，型號分別為3111，1300Series A2）；酶標儀（美國BIOTEK儀器公司，Power Wave X340）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，Centrifuge 5430R）；電泳儀（美國BioRad公司，型號PowerPac Basic 1645050）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LICOR公司，型號ODYSSEY）；實時無標記細胞功能分析儀DP系統(tǒng)（杭州艾森生物有限公司，CA92121）。

β細辛醚（純度98%，金壇市威德龍化學有限公司，批號120MB711V）；Aβ142（上海吉爾生化有限公司，批號052487）；DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，025%胰酶（美國Gibco公司，批號分別為8114420，1581730，1606137）；MTT（美國Amresco公司，批號2273C305）；大鼠IL1β ELISA試劑盒，大鼠TNFα ELISA試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號分別為AB07AD0276，AB07AD0277）；大鼠BDNF ELISA 試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號201505）；NFκB p56抗體（美國Abcam公司，批號GR2093561）；p38MAPK，pp38MAPK，ERK，pERK，JNK，pJNK抗體（Cell Signaling Technology公司，貨號分別為8690s，4511s，4695s，4370s，9528，4668）；Lamin B1抗體（美國ImmunoWay公司，批號B3601）；GAPDH抗體（Santa Cruz公司，批號B0514）；羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗（美國LICOR公司，批號分別為C205315，C4010904）；BCA蛋白定量試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號20130623）；細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒（Beyotime公司，批號0301061503）；細胞全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號Kap2100）；BSA（美國Life公司，批號A925BA0016）；PVDF膜（美國BioRad公司，批號1620177）。

RAh大鼠海馬趾星形膠質(zhì)細胞購自上海斯信生物科技有限公司；高分化PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。

2方法

21藥物與試劑的配制

β細辛醚混懸液：稱取一定量的β細辛醚粉末溶于100 μL DMSO中配制成母液（保證母液配制成所需最高藥物濃度后DMSO的量在終體積01%以下），-20 ℃保存，備用。依據(jù)課題組前期實驗結(jié)果，本文采用1667，555，185 mg·L-1作為實驗劑量（給藥前用PBS稀釋成所需濃度）；Aβ142溶液：將Aβ142寡聚體溶于100 μL無菌PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。給藥前取一定量稀釋至所需濃度即可。

22細胞培養(yǎng)

RAh：培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基，于5% CO2，37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至80%滿度時，025%胰酶消化，1∶3進行傳代。PC12細胞：培養(yǎng)基為含5%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基，其余同RAh。

23共培養(yǎng)體系的建立

向Eplate 16板中加入空培養(yǎng)基測定基線，取對數(shù)生長期的PC12細胞，分別以125×105，25×105，5×105，1×106個/mL的濃度接種于Eplate 16板，每孔100 μL（每個濃度4個復孔）。培養(yǎng)箱內(nèi)放置30 min后檢測，根據(jù)儀器自動生成的阻抗（CI）值和增殖曲線，確定PC12細胞的最佳接種密度；而后將不同濃度（0，25×104，5×104，1×105個/mL）RAh接種于Eplate Insert 16上室（各4孔，孔徑04 μm），單獨培養(yǎng)至貼壁后放入Eplate 16，與PC12共培養(yǎng)，根據(jù)2種細胞的最佳接種濃度，建立共培養(yǎng)體系。

24細胞模型的制備、分組及給藥

241細胞模型的制備首先，取不同濃度Aβ142（33，10，30 μmol·L-1）作用于共培養(yǎng)體系的上室（RAh），觀察共培養(yǎng)體系下室中PC12細胞的增殖曲線，并設(shè)置上室中不含星形膠質(zhì)細胞的對照實驗（含Insert），選取最強作用的Aβ142濃度，制備細胞模型。

242分組及給藥將RAhPC12體系分為正常對照組、Aβ142模型組、β細辛醚185 mg·L-1+ Aβ142組、β細辛醚555 mg·L-1+ Aβ142組、β細辛醚1667 mg·L-1+ Aβ142組。

25PC12細胞存活率的檢測

251RCTA法建立共培養(yǎng)體系后（步驟同23項），分別設(shè)置正常對照組、Aβ142模型組、β細辛醚185 mg·L-1+ Aβ142組、β細辛醚555 mg·L-1+ Aβ142組、β細辛醚1667 mg·L-1+ Aβ142組，給藥組預先給予β細辛醚（185，555，1667 mg·L-1）1 h后給予Aβ142，放入儀器實時檢測，觀察48 h內(nèi)各組的生長曲線，根據(jù)儀器自動生成的阻抗（CI）判斷PC12細胞的存活率。

252MTT法采用96孔板替代RTCA法中的Eplate 16板，操作方法同RTCA法，藥物作用完畢后取出Insert，換入新培養(yǎng)基100 μL，每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。酶標儀檢測490 nm處吸光度。

26ELISA法檢測下室培養(yǎng)液中IL1β，TNFα，BDNF的水平

收集各組下室培養(yǎng)液，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，20 ℃保存，備用。按試劑盒說明書分別檢測各因子的水平。

27Western blot法檢測PC12細胞NFκB的蛋白表達和ERK，P38，JNK的磷酸化水平

采用6孔板和6孔板適配的24 mm Insert，方法步驟同24項。藥物作用48 h后，收集PC12細胞，分成2部分：一部分用于提取細胞核蛋白，一部分用于提取細胞全蛋白。樣品經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳80 V分離2 h，350 mA 90 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5% BSA封閉2 h，剪膜后分別加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的熒光二抗孵育15 h，ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)曝光顯色，蛋白含量用Image Studio Ver 20軟件進行半定量分析。

28統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 602和SPSS 170對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以±s表示。每組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的多個樣本均數(shù)比較采用單因素ANOVA分析，若方程齊采用LSD檢驗，若方程不齊則采用GamesHowell（A）檢驗，P<005為具有顯著性差異，P<001為具有極顯著性差異。

3結(jié)果

31細胞接種密度的確立

按對數(shù)生長期CI值達到1左右為標準選取最佳接種密度，即選取PC12細胞濃度為5×105個/mL；不同濃度（0，25×104，5×104，1×105個/mL）RAh對PC12的增殖無顯著影響，見圖1。本實驗綜合前期篩選的RAh的增殖曲線，選定RAh的接種密度為5×104個/mL。

32不同濃度Aβ142作用于RAh對PC12細胞存活率的影響

RTCA結(jié)果顯示，RAh和PC12共培養(yǎng)24 h，10，30 μmol·L-1 Aβ142能顯著降低PC12細胞的

存活率（P<001），33 μmol·L-1 Aβ142對PC12細胞的存活率無顯著影響；共培養(yǎng)48 h，33，10，30 μmol·L-1Aβ142均顯著降低PC12細胞的存活率（P<001），見圖2。

A上室含RAh；B上室不含RAh；aRTCA法；bMTT法。與正常組比較1）P<005，2）P<001；與Aβ142模型組比較3）P<005，4）P<001（圖3～5同）。

圖2不同濃度Aβ142作用于星形膠質(zhì)細胞對PC12細胞存活率的影響

Fig2Effect of different concentrations of Aβ142 activated astrocytes on viability of PC12 cell

MTT結(jié)果顯示，共培養(yǎng)24 h，33，10 μmol·L-1 Aβ142對PC12細胞的存活率無顯著影響，30 μmol·L-1 Aβ142能降低PC12的存活率（P<005），共培養(yǎng)48 h，10，30 μmol·L-1 Aβ142能顯著抑制PC12細胞的存活率（P<001），Aβ142 3 μmol·L-1對PC12細胞的存活率無顯著影響；同時，RTCA結(jié)果顯示Aβ142（33，10，30 μmol·L-1）作用24，48 h均對PC12細胞的增殖無顯著影響，與MTT的結(jié)果一致，見圖2。綜合以上結(jié)果，本實驗選擇10 μmol·L-1 Aβ142進行后續(xù)實驗研究。

33β細辛醚對Aβ142誘導RAh細胞活化所致PC12細胞損傷的影響

RTCA結(jié)果顯示，RAh和PC12共培養(yǎng)24 h，Aβ142模型組PC12細胞存活率比正常對照組顯著降低（P<001）；β細辛醚（555 mg·L-1）組PC12細胞存活率相比于Aβ142模型組顯著升高（P<001），β細辛醚（185，1667 mg·L-1）組PC12細胞存活率相比于Aβ142模型組無顯著變化；共培養(yǎng)48 h，各組PC12細胞的存活率變化結(jié)果與24 h一致，見圖3。

36β細辛醚對PC12細胞ERK，p38，JNK磷酸化水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，Aβ142模型組的ERK，p38，JNK磷酸化水平均顯著高于正常對照組（P<001）；β細辛醚（185，555，1667 mg·L-1）組ERK的磷酸化水平相比于Aβ142模型組均顯著降低（P<001）；p38的磷酸化水平相比于Aβ142模型組均無顯著影響；與Aβ142模型組相比，β細辛醚（555，1667 mg·L-1）能顯著降低JNK的磷酸化水平（P<001），β細辛醚（185 mg·L-1）對JNK的磷酸化水平無顯著影響，見圖5。

4討論

石菖蒲是廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的中藥，具有神經(jīng)元保護、改善學習記憶等作用。β細辛醚為石菖蒲的主要活性成分之一，在體內(nèi)吸收分布快，且極易通過血腦屏障。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，β細辛醚對東莨菪堿所致的學習記憶獲得障礙、對亞硝酸鈉所致的記憶鞏固障礙及乙醇所致的記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠均有改善記憶的作用，對Aβ2535所致的PC12細胞損傷有抗凋亡作用，對Aβ142誘導星形膠質(zhì)細胞活化所致的損傷有保護作用，顯示出良好的研究前景。

星形膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布最廣的細胞，與神經(jīng)元之間存在復雜的相互作用，其激活介導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病和發(fā)展過程中起著重要的作用8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]AD患者腦中存在大量激活的星形膠質(zhì)細胞，圍繞在神經(jīng)炎性斑塊周圍。Aβ可以引起星形膠質(zhì)細胞的活化，活化的星形膠質(zhì)細胞中含有Aβ片段，為其在Aβ的降解中發(fā)揮作用。這些結(jié)果均表明星形膠質(zhì)細胞在AD中發(fā)揮重要作用。適度激活的星形膠質(zhì)細胞可胞吞Aβ蛋白，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護神經(jīng)元；但過度激活的星形膠質(zhì)細胞，通過釋放神經(jīng)毒性的細胞因子和其他毒性物質(zhì)，誘導神經(jīng)元凋亡，加速AD病理進程。

本實驗通過構(gòu)建星形膠質(zhì)細胞和PC12細胞的共培養(yǎng)體系，更好地模擬腦內(nèi)微環(huán)境和2種細胞相互作用的關(guān)系。將β細辛醚作用于Aβ142活化的RAh細胞，觀察與其共培養(yǎng)的PC12細胞存活率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1 Aβ142作用24，48 h均能使PC12細胞的存活率顯著下降，β細辛醚（555 mg·L-1）能顯著提高PC12細胞的存活率。β細辛醚能有效地抑制Aβ142誘導RAh活化導致的PC12細胞存活率下降，保護PC12細胞。

實驗從抑制炎癥角度，研究β細辛醚發(fā)揮保護作用的初步機制。Aβ寡聚體作用于星形膠質(zhì)細胞，可使星形膠質(zhì)細胞釋放大量炎癥因子，如IL1β，IL6，TNFα，IL8，活性氧等，作為初始的典型炎癥反應(yīng)，這些物質(zhì)對神經(jīng)元有毒性作用，促使神經(jīng)元凋亡[1011]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)β細辛醚能抑制Aβ142活化的星形膠質(zhì)細胞IL1β，TNFα的表達。本實驗采用不同濃度的β細辛醚處理Aβ142活化的星形膠質(zhì)細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β細辛醚（555 mg·L-1）能有效降低共培養(yǎng)下室中IL1β，TNFα水平。Kimura等研究發(fā)現(xiàn)，在AD早期可發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞對Aβ的反應(yīng)性增強，Aβ可誘導星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），促進神經(jīng)元損傷后的存活和修復[1214]，減輕Aβ所致神經(jīng)毒性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，β細辛醚（1667 mg·L-1）能促進BDNF的釋放。介導炎癥最主要的通路為NFκB通路，AD的發(fā)生機制與其轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，持續(xù)的炎癥和氧化應(yīng)激等引起的NFκB過度激活會加劇炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進神經(jīng)元的凋亡；另一條介導炎癥的主要信號通路是MAPK通路，包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase， ERK），cJun 氨基末端激酶（cjun NH2terminal kinase， JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38），一旦MAPK被磷酸化而激活，它可以進一步磷酸化并激活其他激酶或轉(zhuǎn)錄因子，如NFκB和AP1等[15]。本課題組前期實驗結(jié)果表明，β細辛醚能抑制星形膠質(zhì)細胞p38，ERK的磷酸化水平等。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，β細辛醚（555 mg·L-1）能有效抑制下室PC12細胞的NFκB活性和ERK，JNK的磷酸化水平。

綜上所述，β細辛醚可能通過促進BDNF的釋放，降低IL1β，TNFα的水平和ERK，JNK的磷酸化水平，以及抑制PC12細胞NFκB活性而起到保護作用。

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[責任編輯馬超一]