羽葉丁香莖皮中環(huán)烯醚萜類成分

陳蘇依勒　蘇國柱　白睿峰　尹旭　曹愿　屠鵬飛　柴興云

[摘要]通過色譜方法從蒙藥特色藥材山沉香原植物羽葉丁香的莖皮中分到1個新的和5個已知的環(huán)烯醚萜，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜，核磁共振譜等分析，及與文獻數(shù)據(jù)相比對鑒定?；衔?命名為山沉香萜苷A（alashanidoid A）。5個已知成分分別為（8E）女貞子苷（2），異女貞苷（3），3′OβD葡萄糖女貞苷（4），10羥基女貞苷（5），木犀欖苷二甲酯（6），其中3～5為丁香屬內(nèi)首次報道，2和6為本種內(nèi)首次報道?；衔?～6抑制RAW2647細胞中NO生成和HepG2細胞毒的活性篩選，但不顯示明顯的抑制活性。

[關(guān)鍵詞]山沉香；蒙藥；環(huán)烯醚萜；山沉香萜苷A

[Abstract]One new iridoid， named alashanidoid A， and five known analogues， were isolated from the stem bark of Syringa pinnatifolia by various chromatographic methods Their structures were determined on the basis of MS and NMR spectroscopic data analyses， and comparison with those in literature Among them， compounds 35 were isolated from this genus for the first time， and 2 and 6 were isolated from the species for the first timeThese isolates were tested for their in vitro antiinflammatory activities against NO production in lipopolysaccharide（LPS）induced RAW2647 macrophages in mice and cytotoxicity of HepG2 cell line， however， no obvious activity was observed at the concentration of 40 μmol·L-1

[Key words]Syringa pinnatifolia； Mongolian folk medicine； iridoid； alashanidoid A

doi：10.4268/cjcmm20160715

羽葉丁香Syringa pinnatifolia Hemsl又名賀蘭山丁香，為木犀科Oleaceae丁香屬植物，是我國丁香屬特有品種，主要分布在我國內(nèi)蒙、寧夏、甘肅、青海、陜西、四川等地，其中以內(nèi)蒙和寧夏交界的賀蘭山地區(qū)較為集中[1]。羽葉丁香去皮的根、根莖及粗枝，是一種特色蒙藥材——山沉香，蒙藥名“阿拉善·阿嘎如”，具有抑赫依、清熱、止痛等功效，主治心、胸、血性等刺痛、赫依性心激蕩、氣急、主脈赫依病等，蒙醫(yī)用其治療胸悶氣短、心肌缺血等心肺疾病，療效顯著[1]。

為進一步闡明山沉香抗心肌缺血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和充分利用這一寶貴的蒙藥資源，本課題組采用C57BL/6小鼠左冠狀動脈結(jié)扎法評價其抗心肌缺血效果，發(fā)現(xiàn)山沉香乙醇提取物具有顯著的保護缺血性心肌損傷的作用[2]。同時對不納入藥用的莖皮進行化學(xué)研究，以期為山沉香藥效部位的化學(xué)表征提供對照品。采用正、反相硅膠和Sephadex LH20等色譜技術(shù)從山沉香莖皮中分離鑒定了6個環(huán)烯醚萜類成分，其結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜技術(shù)及與文獻數(shù)據(jù)比較鑒定，包括1個新的環(huán)烯醚萜， 定名為山沉香萜苷A（alashanidoid A，1），和5個已知類似物（8E）女貞子苷（2） [3]，異女貞苷（3） [4]，3′OβD葡萄糖女貞苷（4） [5]，10羥基女貞苷（5） [6]，木犀欖苷二甲酯（6） [78]，化合物3～5為丁香屬內(nèi)首次報道，2和6為本種內(nèi)首次報道。

1材料

Varian Inova500型核磁共振儀；日本島津高效液相離子阱飛行時間質(zhì)譜儀；美國魯?shù)婪駻utopol IV旋光儀；Sephadex LH20（瑞典Amershan Biosciences）；Waters 2535制備液相（美國Waters）；半制備色譜柱Shimpack PREPODS（H） C18（20 mm×250 mm，5 μm）。ODS（40～63 μm，德國Merck）；柱色譜用硅膠（200～300目）及薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板，均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；提取和分離中所用化學(xué)試劑均為分析純（北京化工廠）；纖維素酶為北京生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SANYO MCO18AIC細胞培養(yǎng)箱；Motic AE2000倒置熒光顯微鏡；ESCO OptiMair超凈工作臺；瑞士TECAN M1000型多功能酶標(biāo)儀；DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；一氧化氮檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；陽性對照為槲皮素為美國Sigma公司產(chǎn)品。

腹腔巨噬細胞RAW 2647和肝癌細胞HepG2購自上海細胞所。

羽葉丁香2013年7月采自內(nèi)蒙古阿拉善賀蘭山地區(qū)，經(jīng)阿拉善盟蒙醫(yī)醫(yī)院陳蘇依勒鑒定為S pinnatifolia，異名賀蘭山丁香S pinnatifolia var alashanensis YC Ma & SQ Zhou[1]，剝?nèi)∏o皮，陰涼處干燥，憑證標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心（SP201307B）。

2提取與分離

山沉香莖皮（13 kg），依次用95%和80%的乙醇回流提取2次，每次25 L，提取15 h。提取液減壓濃縮得浸膏325 g。采用正相硅膠柱色譜，依次用氯仿甲醇（20∶1～0∶1）洗脫得到9個流分（A～I）。E（106 g）和F（82 g）合并采用正相硅膠柱色譜，以乙酸乙酯甲醇（10∶1～0∶1）洗脫得到8個流分（EF1～EF8）。EF1（12 g）經(jīng)反相硅膠分離甲醇水（1∶2～1∶0）洗脫，Sephadex LH20柱色譜甲醇洗脫、純化得到化合物3（35 mg）和4（65 mg），其余部分通過HPLC制備液相（30 mL·min-1，乙腈水18∶82）得到化合物1（tR=245 min，65 mg）和6（tR=273 min，102 mg）。EF3（25 g）經(jīng)HPLC制備液相（甲醇水，40∶60）純化得到化合物2（tR=333 min，5005 mg）和5（tR=435 min，2001 mg）?；衔?～6結(jié)構(gòu)式見圖1。

3抗炎和肝癌細胞毒篩選

取對數(shù)生長期的RAW2647細胞，按每孔2×105個細胞數(shù)接種于96孔板中，24 h后加入50 μL不同濃度的單體化合物，2 h后加 50 μL LPS（1 mg·L-1）刺激24 h，加MTT，孵育4 h，570 nm下測細胞A，以630 nm作為校正波長。取細胞上清 50 μL，采用Griess法測定一氧化氮（NO）的含量。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按5×104細胞數(shù)接種于96孔中，孵育24 h貼壁后加入100 μL不同濃度的單體化合物，培養(yǎng)24 h，加MTT，孵育4 h，570 nm下測細胞A，以 630 nm作為校正波長。抑制率按照下式計算：抑制率=（A模型-A給藥） / A模型×100%。

4結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1褐色糖漿狀，[α]25D-974（c 01，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε） ：277（308）， 226（396）， 202（384） nm；IR（KBr）vmax：3 132， 1 630， 1 516，1 400， 1 309， 1 158， 1 078 cm-1；HRESIMS m/z 709232 6 [M +Na]+（計算相對分子質(zhì)量709232 4 ， C31H42O17Na），結(jié)合其核磁數(shù)據(jù)確定分子式為C31H42O17，不飽和度11。

1HNMR（CD3OD，500 MHz）數(shù)據(jù)見表1，結(jié)合HSQC圖譜分析顯示，化合物1中含有AA′BB′型芳香質(zhì)子[δH 705（2H，d，J=80 Hz，H2″，6″），668（2H，d，J=80 Hz，H3″，5″）]，2個烯質(zhì)子δH 751（1H，br s，H3），610（1H，br q，J=70 Hz，H8），1個甲氧基δH 371（3H，s）和1個甲基δH176（3H，d，J=70 Hz），2個端基質(zhì)子δH 479（1H，d，J=75 Hz，H1′），δH 435（1H，d，J=80 Hz，H1）及糖上其他質(zhì)子信號。13CNMR（CD3OD，125 MHz）見表2，顯示31個碳信號，包括2個酯羰基δC 1729（C7）和1689（C11），4個季碳δC 1568（C4″），1306（C1″），1305（C9），1093（C4），2個烯碳δC 1553（C3），1251（C8），4個芳香碳δC 1309×2，1161×2，1個連氧碳δC 722（Cα），3個飽和碳δC 363（Cβ），316（C5），407（C6），1個甲氧基δC 519，1個甲基δC 137，以及2組糖上碳信號。上述歸屬并結(jié)合詳細的HMBC分析可以明確化合物1中含有1個對羥基苯乙醇片段，而且由H1到Cα的HMBC相關(guān)顯示苯乙醇片段與其中1個糖相連。其他除糖之外的NMR數(shù)據(jù)分析可以判斷分子中存在一個環(huán)烯醚萜結(jié)構(gòu)，詳細的HMBC關(guān)系見圖1。另一個糖端基信號H1′與C1相關(guān)，提示環(huán)烯醚萜在C1位成苷。上述分析顯示，化合物1與已知化合物（8E）女貞子苷（2）[3]和異女貞苷（3）[4]結(jié)構(gòu)非常近似。詳細比較其13CNMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，除C2[ΔδC-（ 14～19 ）]，C3[ΔδC +（15～34） ]，C4[ΔδC-（08～32） ]，C5[ΔδC +（19～26 ）]的化學(xué)位移發(fā)生了一定變化外，其他位置數(shù)據(jù)基本保持一致，基于糖基酯化對相鄰碳化學(xué)位移的影響，并與文獻中itosides C和F[9]中相似的變化規(guī)律相符，最終確定C3位與C7酯羰基相連，確定了化合物1結(jié)構(gòu)各片段的連接順序。糖的類型經(jīng)酶水解后分析確定，具體操作如下：將DMSO溶解的化合物1（095 mg）與等質(zhì)量的纖維素酶一同加入乙酸乙酸鈉緩沖鹽溶液中（pH 45，20 mL）。混合溶液在溫度40 ℃靜置12 h后與等體積的乙酸乙酯混合，萃取，振搖，取下層水液濃縮、與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品TLC及旋光數(shù)據(jù)比對，鑒定為βD葡萄糖。上層溶液濃縮后，通過LCMS分析確定對羥基苯乙醇和環(huán)烯醚萜苷元。

在ROSEY譜中可以看到H1與H6相關(guān)，表明H1與H5異面；H10與H5相關(guān)可判斷雙鍵構(gòu)型為E構(gòu)型，進一步結(jié)合旋光數(shù)據(jù)及與文獻比對[3]，確定化合物1的相對構(gòu)型分別為H1α和H5β，最終鑒定了化合物1的結(jié)構(gòu)，經(jīng)SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索為一未知結(jié)構(gòu)，定名為山沉香萜苷A（alashanidoid A）。

化合物2白色粉末，[α]25D-1023（c 017，MeOH）；HRESIMS m/z 685232 1[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR數(shù)據(jù)分別見表1，2。以上數(shù)據(jù)與文獻[3]報道一致，故鑒定為（8E）女貞子苷[（8E）nüzhenide]。

化合物3黃色粉末，[α]25D-916（c 002，MeOH）；HRESIMS m/z 685232 1[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR數(shù)據(jù)分別見表1，2。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，故鑒定為異女貞苷（isonüezhenide）。

化合物4白色粉末，[α]25D-720（c 01，MeOH）；HRESIMS m/z 685231 2[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR數(shù)據(jù)分別見表1，2。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，故鑒定為3′OβD葡萄糖女貞苷（3′OβDglucopyranosylligustroside）。

化合物5黃色糖漿狀，[α]25D-1360（c 007，MeOH）；HRESIMS m/z 563163 8[M + Na]+，分子式C25H32O13，1H和13CNMR數(shù)據(jù)分別見表1，2。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定為10羥基女貞苷（10hydroxyligustroside）。

化合物6黃色糖漿狀，[α]25D-1840（c 0082，MeOH）；HRESIMS m/z 463145 2 [M + HCOO]-，分子式為C18H26O11，1H和13CNMR數(shù)據(jù)分別見表1，2。以上數(shù)據(jù)與文獻[78]報道一致，故鑒定為木犀欖苷二甲酯（oleoside dimethyl ester）。

化合物1～6在40 μmol·L-1濃度對LPS誘導(dǎo)RAW2647細胞NO生成（槲皮素為陽性對照）和HepG2細胞毒均不顯示抑制作用。

5結(jié)果與討論

丁香屬植物的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜類、木脂素類、苯乙醇及苯丙素類[10]，而羽葉丁香去皮的莖和根中的主要成分為木脂素[1]，此前一直沒有環(huán)烯醚萜的報道。本研究首次對羽葉丁香莖皮進行了化學(xué)成分研究，從中分離鑒定6個環(huán)烯醚萜類，包括1個新的和5個已知類似物。研究結(jié)果既為羽葉丁香與同屬其他植物的分類學(xué)提供了化學(xué)分類依據(jù)，也在一定程度上證明了環(huán)烯醚萜類極少產(chǎn)生于羽葉丁香的莖木，而更多在樹皮或葉中，這或許與植物利用此類物質(zhì)防御螞蟻侵襲等生態(tài)學(xué)功能相關(guān)[11]，同時也暗示環(huán)烯醚萜類成分不是山沉香抗心肌缺血的藥效物質(zhì)。

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[責(zé)任編輯丁廣治]