含水量對川牛膝種子活力的影響及其抗老化機(jī)制分析

王倩　楊梅　裴瑾　王黎　吳沂蕓　呂燴

[摘要]以川牛膝Cyathula officinalis種子為材料，通過高溫高濕法進(jìn)行人工加速老化，研究9個含水量對川牛膝種子活力的影響，并對不同含水量的抗老化機(jī)制進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明，人工老化后，種子活力普遍有所降低；總體而言，含水量655%～478%的種子活力及抗老化能力相對較強(qiáng)，種子電導(dǎo)率值、POD活性、MDA含量升高幅度均較小，脫氫酶和SOD活性降低幅度亦較小；且在種子含水量577%時，未老化種子發(fā)芽試驗各指標(biāo)最高，人工老化和未老化的種子POD活性均最低，浸出液電導(dǎo)率較低，脫氫酶、SOD活性均最高，CAT活性亦較高。因此，在對川牛膝種子進(jìn)行低溫種質(zhì)庫保存時，為使其保持較高的活力和抗老化能力，應(yīng)考慮將含水量降至接近（570±1）%。

[關(guān)鍵詞]川牛膝；含水量；人工老化；種子活力；抗老化機(jī)制；低溫種質(zhì)庫保存

[Abstract]Effects of nine different moisture contents on vigor of Cyathula officinalis seeds and its antiaging mechanism were studied by artificial accelerated aging through high temperature and wet The research results showedthat seed vigor were generally decreased after artificial aging； in general， seed vigor and its antiaging ability are relatively stronger within the scope of 655%478% moisture content， the increase range of seed conductivity， peroxidase activity， malondialdehyde content，and reduce amplitude of activityof dehydrogenase ， superoxide dismutaseare alllower as well And when the moisture content reduced to 577%， all of the germination tests index of the nonaged seeds are the highest， and the activity of peroxidase the lowest，conductivity of leaching solution relatively low， activity of dehydrogenase and superoxide dismutase the highest，and catalase activityrelatively highTherefore， in the low temperature germplasm preservation of C officinalis seeds， the seed moisture content should be controlled close to the range of （570±1）% to keep higher vigor and antiaging ability

[Key words]Cyathula officinalis； moisture content； artificial aging； seed vigor； antiaging mechanism； low temperature germplasm preservation

doi：10.4268/cjcmm20160711

川牛膝，來源于莧科杯莧屬多年生草本植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，為臨床常用中藥，以種子繁殖為主。種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)和種用價值的重要組成部分，老化是種子在貯藏過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，可影響種子活力和壽命。良好的貯藏環(huán)境可減慢種子的老化速度，對于川牛膝等以種子繁殖為主的藥用植物種子的保存而言，低溫種質(zhì)資源庫是最簡便、最經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用最普遍的方法[1]。在低溫種質(zhì)庫貯藏條件下，含水量是影響種子活力的關(guān)鍵因素之一[2]。自然狀態(tài)下，短時間內(nèi)不易得到不同程度的老化種子，通過人工老化[34]的方法可以解決這一問題，從而在較短的時間內(nèi)了解種子活力變化，預(yù)測其耐貯藏情況。本試驗以川牛膝種子為研究對象，以期確定其低溫種質(zhì)資源庫中保存的最佳含水量，為其低溫長期保存關(guān)鍵技術(shù)及后續(xù)國家中藥種質(zhì)資源庫（成都）的運(yùn)行提供參考。

1材料

供試材料為2014年11月于四川樂山金口河收獲的川牛膝種子，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定為莧科杯莧屬植物川牛膝C officinalis的種子。試驗前將種子保存于國家中藥種質(zhì)資源庫的低溫種質(zhì)庫中。參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（1995）含水量測定方法，將初始含水量1125%的川牛膝種子，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中（50 ℃）烘干至含水量分別為712%，655%，605%，577%，520%，478%，425%，375%。將不同含水量的種子分成2份，一份進(jìn)行人工老化（高溫高濕法）后鋁箔紙袋密封保存，另一份直接鋁箔紙袋密封保存。

2方法

21發(fā)芽試驗參考張祎楠[5]的發(fā)芽試驗方法。以濾紙為發(fā)芽床，發(fā)芽溫度設(shè)定為25 ℃，培養(yǎng)皿水分為70%，光照條件為8 h光照/16 h黑暗。首次計數(shù)時間為第2天，末次計數(shù)時間為第10天，每份材料重復(fù)3次，每次重復(fù)隨機(jī)取不同含水量的川牛膝種子100粒進(jìn)行發(fā)芽，胚軸長度達(dá)到真種子自身長度時計為發(fā)芽。統(tǒng)計萌發(fā)情況，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率=最終發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總粒數(shù)×100%

發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總粒數(shù)×100%，本實驗以第7天作為計算發(fā)芽勢的時間。

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt），Gt為在第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

22浸出液電導(dǎo)率測定參考文獻(xiàn)[6]的方法。取不同含水量的川牛膝干凈種子各200粒于燒杯中，加100 mL去離子水，以去離子水作對照，20 ℃浸泡24 h，然后取出種子采用DDSJ308A電導(dǎo)率儀測定種子浸出液和對照組的電導(dǎo)率。

23過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]。以愈創(chuàng)木酚為底物，酶液用磷酸二氫鉀溶液分離提取，加pH 60的磷酸緩沖液，以反應(yīng)混合液3 mL和KH2PO4 1 mL為對照，測定在470 nm波長下吸光度，每分鐘吸光度變化表示酶活性大小。

24丙二醛（MDA）含量測定參考朱誠等[8]的方法，結(jié)合硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛含量。取不同含水量的川牛膝種子各05 g，加2 mL 10%的三氯乙酸溶液，研磨成勻漿，再加8 mL三氯乙酸溶液進(jìn)一步研磨，取勻漿經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min。取上清液2 mL，加2 mL 06%的硫代巴比妥酸溶液，在沸水上水浴15 min，迅速冷卻后離心，取上清液測定532，600，450 nm波長下的吸光度。

25脫氫酶活性測定（TTC定量法）將不同含水量的川牛膝種子在25 ℃恒溫中發(fā)芽72 h后，隨機(jī)取萌發(fā)種子20粒，重復(fù)3次。將種胚剝出，放入試管中，加入04%氯化三苯基氮唑（TTC）溶液和磷酸緩沖液（pH 7）各5 mL，使種胚充分浸沒在溶液中，在37 ℃保溫2 h，取出后立即加入濃度為1 mol·L-1的硫酸2 mL以終止反應(yīng)。將樣品吸干水分后放入研缽中，加乙酸乙酯4 mL充分研磨后以3 000 r·min-1離心5 min，將上清液移至10 mL刻度試管中，加乙酸乙酯定容并搖勻。以乙酸乙酯為對照，取提取液在A580型雙光束紫外可見分光光度計485 nm波長下測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的TTC還原量，定量計算脫氫酶活性。

26總超氧化物歧化酶（TSOD）活性測定（試劑盒法）測定原理：試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O-·2），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，550 nm測定其吸光度；當(dāng)被測樣品含SOD時，可專一性抑制超氧陰離子自由基，使其形成的亞硝酸鹽減少，吸光度降低，通過公式即可計算樣品中總SOD的活性。本研究以不同含水量川牛膝種子發(fā)芽1周的子葉為材料。

27過氧化氫酶（CAT）活性測定（試劑盒法）測定原理：過氧化氫酶分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，于405 nm處測定其變化量，可計算出CAT活性。本研究以不同含水量川牛膝種子發(fā)芽1周的子葉為材料。

3結(jié)果與分析

31發(fā)芽試驗未老化川牛膝種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均隨其含水量的降低總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，含水量577%時，各項種子活力指標(biāo)均表現(xiàn)為最高水平。人工老化處理后，種子活力除在含水量478%時較低外，其余含水量對應(yīng)活力指標(biāo)均無顯著變化且保持在較高水平；種子活力在712%～425%均低于未老化者，其中以含水量52%的種子活力下降幅度最小，含水量478%時的下降幅度最大，見圖1～3。

32電導(dǎo)率的測定高活力的種子細(xì)胞膜完整性好，浸入水中后滲出的可溶性物質(zhì)或電解質(zhì)少，浸出液的電導(dǎo)率低；反之，則高。當(dāng)種子含水量高于577%時，未老化和人工老化的種子電導(dǎo)率均隨含水量的降低先上升后下降，均以含水量577%時的電導(dǎo)率較低；當(dāng)含水量低于577%時，電導(dǎo)率均再次出現(xiàn)不同程度的升高。人工老化后，種子電導(dǎo)率在含水量577%～478%的升高幅度隨含水量的降低而減小，含水量為425%時的升高幅度最大，見圖4。

33過氧化物酶（POD）活性的測定人工老化和未老化種子的POD活性隨種子含水量的降低均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中含水量577%時，POD活性均最低。在605%～478%含水量，未老化種子的POD活性無明顯變化且保持在較低水平；含水量高于605%時，種子POD活性隨含水量的降低出現(xiàn)明顯下降；含水量低于478%時，種子POD活性隨含水量的降低而顯著升高。經(jīng)過人工老化處理后，種子POD活性較未老化種子出現(xiàn)不同程度的升高；在655%～52%的含水量，POD活性的升高幅度較小并保持在較低水平，且以含水量577%時POD活性的升高幅度最小，見圖5。

34丙二醛（MDA）含量的測定種子在老化過程中，會發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，丙二醛（MDA）是其產(chǎn)物之一，丙二醛含量越高，種子活力越低，反之亦然。未老化和人工老化的川牛膝種子浸出液MDA含量隨種子含水量的降低整體均呈現(xiàn)上升趨勢，含水量577%為2種處理下MDA含量明顯上升的拐點(diǎn)。人工老化后，MDA含量在含水量712%～375%時均高于未老化組，且在655%～478%，MDA含量升高幅度較小，含水量為425%時的升高幅度最大，見圖6。

35脫氫酶活性的測定脫氫酶與種子呼吸作用中的能量化合物密切相關(guān)，其活性越高，種子活力越高，反之亦然。人工老化處理種子和未老化種子的脫氫酶活性隨著其含水量的降低總體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以含水量577%時的脫氫酶活性均最高，含水量1125%時最低。人工老化后，含水量712%～375%，脫氫酶活性均有所降低；在712%～605%，478%～375%含水量的脫氫酶活性降低幅度均隨含水量降低而增大；含水量605%～478%時，脫氫酶活性隨含水量降低而減小，見圖7。

36總超氧化物歧化酶（TSOD）活性的測定超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧陰離子自由基（O-·2），保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活性越高，種子活力則越高，反之亦然。人工老化后，多數(shù)種子的超氧化物歧化酶活性有所降低；在含水量605%～425%，2種處理的種子的總超氧化物歧化酶活性均隨含水量的降低呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且此范圍內(nèi)的酶活性均以含水量577%時最高；含水量577%～478%的酶活性降低幅度較小，見圖8。

37過氧化氫酶（CAT）活性的測定過氧化氫酶普遍存在于植物組織中，是重要的保護(hù)酶之一，其作用是清除代謝中產(chǎn)生的H2O2，以避免H2O2積累對細(xì)胞的氧化破壞作用，因而，其活性越高，種子活力越高。老化后，大多數(shù)種子的過氧化氫酶活性有所降低，但與老化前的酶活性相差不大；含水量605%，577%時，種子酶活性均較高，且含水量605%時，過氧化氫酶活性降低幅度較小，見圖9。

4討論

41含水量對川牛膝種子活力的影響以收集保存種子為主題的低溫種質(zhì)庫是當(dāng)今保護(hù)植物種質(zhì)資源最為普遍且可靠易行的方式，適當(dāng)降低含水量可使種子在低溫或超低溫的情況下保持很好的活力[9]。目前，種子活力的測定方法有很多，其中國際種子檢驗協(xié)會（ISTA）推薦使用的方法為電導(dǎo)率法和加速老化法[10]。本研究采用人工加速老化法研究了9個含水量對川牛膝種子活力的影響，測定了種子發(fā)芽指標(biāo)、種子浸出液電導(dǎo)率、MDA含量、POD、脫氫酶、總SOD及CAT活性。結(jié)果表明，人工老化后，種子活力普遍有所降低，種子電導(dǎo)率在577%～478%含水量的升高幅度較小，POD活性在655%～52%含水量時的升高幅度較小并保持在較低水平，MDA含量在655%～478%升高幅度較小，脫氫酶活性降低幅度在含水量605%～478%時隨含水量降低而減小，總SOD活性在含水量577%～478%時下降幅度較小，CAT活性在含水量605%時較高且老化后的降低幅度較小。總之，在含水量655%～478%，川牛膝種子抗老化能力較強(qiáng)，種子活力較高。且在種子含水量577%時，未老化種子發(fā)芽試驗各指標(biāo)均為最高，2種處理的種子POD活性均最低，浸出液電導(dǎo)率較低，脫氫酶、總SOD及CAT活性均較高。因而，后續(xù)對于川牛膝種子低溫種質(zhì)庫中保存最佳含水量的確定可在（570±1）%進(jìn)行進(jìn)一步的篩選研究。

42含水量對川牛膝種子的抗老化機(jī)制分析

目前，關(guān)于種子活力喪失的機(jī)制尚不完全清楚，但膜脂過氧化和自由基被認(rèn)為是主要原因[11]。膜脂過氧化，膜透性增加，溶質(zhì)外滲，合成能力下降，激素也發(fā)生變化，保護(hù)性酶的活性降低，清除自由基及過氧化物的能力減弱；自由基不斷積累，攻擊膜磷脂分子的不飽和脂肪酸，膜被破壞，透性增大，MDA等有毒物質(zhì)積累[12]，造成種子活力下降。種子中的水分依據(jù)其存在狀態(tài)分為游離水、結(jié)合水及中間過渡類型，其中，游離水的多少直接關(guān)系到種子的生理生化過程，從而影響種子品質(zhì)與貯藏壽命。本研究中，適當(dāng)降低含水量可減緩種子老化程度，可能即是因自由基活躍程度受自由水（游離水）含量影響[11]的緣故。

本研究中，人工老化后的種子POD活性較未老化種子均出現(xiàn)不同程度的升高，這與已報道文獻(xiàn)[1314]研究結(jié)果不一致。究其原因，可能與POD不僅具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞的作用[15]，也能使某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度[16]，并可能具有生長素氧化酶的性質(zhì)[17]有關(guān)，從而導(dǎo)致在老化種子中活性較高。因而，本研究對超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）亦進(jìn)行了活性測定，結(jié)果表明，2種酶在老化種子中的活性普遍有所降低。由2種酶的測定原理可知，二者可分別通過專一性地抑制超氧陰離子自由基（O-·2）自由基和清除H2O2達(dá)到保護(hù)種子活力的作用，且二者活性在577%～478%含水量抗老化作用較強(qiáng)，進(jìn)一步佐證了前述種子活力喪失機(jī)制的觀點(diǎn)[1112]。因此，對于低溫種質(zhì)庫中種子的保存而言，最佳含水量的研究不可或缺。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]