補益類復方中藥調(diào)控流感病毒樣顆粒免疫小鼠外周血白細胞介素17A的表達水平

林巧　邱勇龍　侯杏芳　鄭軍　張國良　曾進　劉映霞　聶廣

518126　深圳市寶安區(qū)慢性病防治院綜合門診(林巧、邱勇龍、鄭軍、曾進)；深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所(侯杏芳、張國良、劉映霞、聶廣)

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·論著·

補益類復方中藥調(diào)控流感病毒樣顆粒免疫小鼠外周血白細胞介素17A的表達水平

林巧邱勇龍侯杏芳鄭軍張國良曾進劉映霞聶廣

518126深圳市寶安區(qū)慢性病防治院綜合門診(林巧、邱勇龍、鄭軍、曾進)；深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所(侯杏芳、張國良、劉映霞、聶廣)

【摘要】目的探討補益類復方中藥對流感病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)免疫小鼠外周血白細胞介素17A(interleukin 17A，IL-17A)表達的影響。 方法將42只BALB/C小鼠隨機分為VLPs組、VLPs+益氣方組、VLPs+補血方組、VLPs+滋陰方組、VLPs+壯陽方組、VLPs+霍亂毒素組和PBS組共7組，每組6只，分別于0和14天通過鼻腔使用VLPs(10 μg/次)進行免疫，聯(lián)合中藥組在第1至第13天連續(xù)灌服中藥。中藥佐劑按生藥量200 mg/kg劑量接種。在免疫第0天、13天及28天采集外周血并分離血漿和單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組外周血漿IL-17A濃度，利用酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay，Elispot)檢測PBMC中分泌IL-17A的細胞數(shù), 即斑點形成集落數(shù)(spot forming cells，SFCs)。 結(jié)果(1)無論是在免疫應答早期還是后期，VLPs能有效誘導外周血漿中IL-17A的分泌，而聯(lián)合益氣方組血漿中IL-17A水平進一步提高(P<0.05)；(2) Elispot技術能有效檢測PBMCs中分泌IL-17A的陽性細胞。與單純VLPs免疫組相比，益氣方和滋陰方均能顯著增加分泌IL-17A的細胞數(shù)(P<0.01)，在免疫后28天尤為明顯。 結(jié)論益氣方、滋陰方可以顯著增強流感VLPs誘導的IL-17A表達水平，益氣聯(lián)合滋陰方有望成為新型流感疫苗佐劑。

【關鍵詞】補益類復方中藥；流感；病毒樣顆粒；白細胞介素-17A

由于流感病毒通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變的形式產(chǎn)生免疫逃逸[1]，目前臨床上應用的流感疫苗并不能滿足多種亞型流感病毒，因此增強疫苗免疫原性、尋找安全高效的疫苗佐劑成為當今研究熱點。白細胞介素17A(interleukin 17A，IL-17A)是主要由輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)細胞分泌的具有多種生物學效應的細胞因子，可以誘導機體產(chǎn)生多種細胞因子、趨化因子、炎癥效應物質(zhì)和抗微生物蛋白，在天然免疫和宿主防御中發(fā)揮重要作用。研究證實IL-17信號通路缺失的小鼠對利什曼原蟲感染更為易感[2]，同時A型流感病毒可以抑制Th17細胞介導的宿主抗細菌免疫應答[3]。

既往研究表明多種中草藥具有多方面的免疫活性，能影響和調(diào)節(jié)機體的免疫功能，尤其是補益類中藥[4]。前期實驗中課題組也發(fā)現(xiàn)補益類復方中藥能夠增強流感病毒樣顆粒(virus like particles, VLPs)疫苗免疫原性，但其對免疫小鼠IL-17A應答水平的影響尚不清楚。為此本研究檢測不同中藥聯(lián)合VLPs免疫方案誘導小鼠產(chǎn)生特異性IL-17A分泌水平的差異，進一步明確補益類中藥作為佐劑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子機制，為臨床應用補益類復方中藥佐劑奠定理論基礎。

1材料和方法

1.1實驗動物

BALB/C小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2014-0035，共42只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(20.5±2.3) g，飼養(yǎng)于深圳市第三人民醫(yī)院SPF級動物實驗室。

1.2試驗藥物

本研究分別以益氣、養(yǎng)血、滋陰、壯陽為組方原則，制備不同種類補益類復方中藥，其中益氣方由黨參20 g、黃芪10 g、茯苓10 g組成；養(yǎng)血方由當歸15 g、白芍15 g、制首烏10 g組成；滋陰方由麥冬15 g、枸杞15 g、石斛10 g組成；壯陽方由淫羊藿15 g、補骨脂10 g、懷牛膝10 g組成(以上中藥量均為生藥量)。中藥免煎顆粒劑購自廣東一方制藥公司，生產(chǎn)批號：140813，1 g/袋，分別相當于生藥量為：黨參10 g、黃芪10 g、茯苓10 g、當歸10 g、白芍10 g、制首烏5 g、麥冬10 g、枸杞10 g、石斛10 g、淫羊藿5 g、補骨脂5 g、懷牛膝10 g。以霍亂毒素(cholera toxin，CT)作為黏膜佐劑陽性對照，PBS作為空白對照組灌服試劑。

1.3試劑與儀器

小鼠淋巴細胞分離液(DKW33-R0100)購自深圳達科為生物公司;DMEM(12491-015)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，10437-028)均購自美國Gibco公司;IL-17A酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(M1700)購自美國R&D公司;IL-17A單克隆包被抗體(sc-374218)、生物素標記二抗(sc-7927)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(sc-2004)均購自美國Santa Cruz公司;流感VLPs疫苗由課題組前期自行制備[5]，多功能酶標儀和CO2細胞培養(yǎng)箱為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;Elispot讀數(shù)系統(tǒng)購自德國AID公司。

1.4模型制備和觀察指標

1.4.1免疫方案制定及血漿、外周血單核細胞的制備應用隨機數(shù)字表法將42只小鼠分為VLPs組、VLPs+益氣方組、VLPs+養(yǎng)血方組、VLPs+滋陰方組、VLPs+壯陽方組、VLPs+霍亂毒素組和PBS組7組，每組6只。于第0和14天通過鼻腔以10 μg/次劑量進行流感VLPs免疫。在第1天至第13天，VLPs+益氣方組、VLPs+養(yǎng)血方組、VLPs+滋陰方組、VLPs+壯陽方組每天通過灌胃的方式分別灌入益氣方、補血方、滋陰方及壯陽方，中藥按生藥量200 mg/kg劑量接種，灌胃體積按0.2 mL/10g體重計算，霍亂毒素按1 μg/次接種。分別于0天(免疫前)、13天(最后一次服用中藥)及28天采集各組小鼠外周肝素鋰抗凝血[6]，離心獲得血漿，-80℃保存，剩余細胞采用密度梯度離心法分離外周血單核細胞((peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，凍存于液氮中備用。

1.4.2利用ELISA檢測血漿中IL-17A水平根據(jù)IL-17A ELISA試劑盒說明書，首先向酶標板中加入100 μL Assay Diluent活化抗體，之后加入100 μL血清室溫孵育3小時，PBST洗滌3次后，加入200 μL酶標二抗室溫孵育1小時，PBST洗滌3次后加入200 μL底物進行顯色，然后使用多功能酶標儀測定450 nm吸光度。最后根據(jù)標準曲線將樣品OD值換算為蛋白濃度。

1.4.3利用Elispot檢測PBMCs中分泌IL-17A的細胞數(shù)使用包被緩沖液將抗鼠IL-17A特異性單克隆抗體稀釋為3 μg/mL，向96孔板中加入100 μL/孔，4℃過夜。將各組免疫小鼠PBMCs按1.0×105/孔鋪板，同時加入終濃度為2 μg/mL的VLPs進行刺激，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)36小時，PBST洗滌3次，隨后加入生物素標記的二抗和辣根過氧化物酶標記的親和素，底物顯色后根據(jù)形成的斑點數(shù)判斷細胞因子表達水平的高低。待顯色洗板后, 在Elispot讀數(shù)系統(tǒng)自動讀數(shù), 并記錄斑點形成集落數(shù)。

1.5統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1補益類復方中藥對VLPs免疫小鼠血漿中IL-17A表達水平的影響

免疫后第13天，VLPs及VLPs聯(lián)合中藥均能誘導小鼠外周血漿中IL-17A表達，其中益氣方組IL-17A濃度為(59.8±9.0)ng/mL，表達水平最高，與單純VLPs組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫后第28天，VLPs及VLPs聯(lián)合中藥組IL-17A表達水平進一步提高，仍以益氣方組升高最為明顯，高達(75.3±8.4)ng/mL，顯著高于單純VLPs組(P<0.01)。無論是在免疫早期還是免疫后期，其他聯(lián)合中藥組與單純VLPs組差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表1。

2.2補益類復方中藥對VLPs免疫小鼠PBMCs中分泌IL-17A細胞數(shù)的影響

由于外周血漿中IL-17A水平較低，而Elispot技術是檢測PBMCs中分泌IL-17A的細胞數(shù)，其斑點數(shù)代表IL-17A陽性細胞數(shù)，與ELISA技術相比，敏感性、特異性更佳。如圖1所示，不同免疫方案的PBMCs中IL-17A斑點形成集落數(shù)存在顯著差異。

通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在免疫后第13天和第28天，益氣方組和滋陰方組均能顯著提高IL-17A斑點形成集落數(shù)，與單純VLPs組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而養(yǎng)血方和壯陽方對IL-17A斑點形成集落數(shù)影響不顯著，差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表2。

表1　不同免疫方式的BALB/C小鼠在不同時間點

注： 與VLPs組相比，aP<0.05，bP<0.01。

表2　不同免疫方式的BALB/C小鼠在不同時間點

注： 與VLPs組相比，aP<0.01。

3討論

IL-17主要是由Th17細胞分泌的細胞因子，該家族包括6個成員的配體(IL-17A～IL-17F)和5個受體(IL-17RA～IL-17RD和SEF)，是最近新發(fā)現(xiàn)的具有強大的促炎癥作用的細胞因子家族，能誘導各種免疫反應來對抗病原體，因此它具有抗感染和促炎癥雙重功能[7]。如Yamazaki等[8]研究顯示IL-17A與皮膚黏膜的白色念珠菌感染有關，白色念珠菌病疾病患者體內(nèi)IL-17 A表達水平減少。IL-17A也與細菌感染有關，Montgomery等[9]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在金黃色葡萄球菌皮膚感染中具有保護作用。

另外也有研究發(fā)現(xiàn)，在支氣管腺病毒感染的小鼠模型中，IL-17A能募集中性粒細胞，但是缺乏抑制病毒復制的作用[10]。以上研究表明IL-17A在各類感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色。

中藥能促進造血細胞生成，促進IL-1、IL-2、IL-12、 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 、 干擾素

圖1　Elispot技術檢測各組免疫小鼠外周血PBMCs 中IL-17A斑點形成集落數(shù)

(interferon，IFN)等細胞因子的分泌，刺激、加強細胞因子的作用，增強機體的細胞免疫和體液免疫，活化補體，提高機體的免疫功能，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。另外中藥還能有效激活T細胞，如枸杞多糖、女貞子多糖、黃芪多糖可以增強輔助性T細胞功能，具有類似胸腺素樣的免疫調(diào)節(jié)作用[11]。既往研究報道復方中藥能夠調(diào)節(jié)IL-17A的產(chǎn)生，如李學良等[12]研究發(fā)現(xiàn)宣肺固本中藥能夠降低哮喘模型大鼠外周血IL-17A的表達，Wang等[13]的研究表明補腎益氣類中藥能顯著降低慢性阻塞性肺病患者體內(nèi)的IL-17A表達，從而緩解肺臟局部炎癥反應，但是中藥能否有效調(diào)控流感VLPs誘導的免疫應答尚不清楚。

在本研究中，課題組以中醫(yī)益氣、養(yǎng)血、滋陰、壯陽為組方原則，每種處方選取3種代表性藥物，然后協(xié)同流感VLPs疫苗免疫BALB/C小鼠，通過ELISA和Elispot兩種實驗技術檢測免疫小鼠外周血漿和PBMCs中IL-17A的表達情況，發(fā)現(xiàn)益氣方可以顯著提升小鼠外周血漿中的IL-17A水平(P<0.05)，而對于胞內(nèi)的IL-17A表達，益氣方和滋陰方均能顯著提升(P<0.01)。以上結(jié)果提示，滋陰方可以在細胞水平增加IL-17A表達，而益氣方則不僅可以增加細胞內(nèi)IL-17A表達，更能有效促進IL-17A的分泌，從而介導更廣泛的免疫應答。因此益氣聯(lián)合滋陰有望成為作為新型的免疫佐劑，從而提高流感VLPs疫苗的免疫保護效果。

然而本研究仍需要通過其他實驗進一步完善，首先是益氣方和滋陰方究竟通過什么調(diào)控機制影響IL-17A表達？是促進IL-17A轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達，還是抑制調(diào)節(jié)性T細胞功能？其次究竟是哪一類單體成分發(fā)揮有效作用，進而促進IL-17A表達？最后是IL-17A具有抗微生物和促炎雙重作用，過度產(chǎn)生IL-17A是否對機體產(chǎn)生病理損害？究竟在什么濃度范圍之間才能到達最佳免疫效果？以上研究內(nèi)容將是本課題組下一步的工作重點。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Regulating effect of tonic herbal compound in IL-17A expression induced by influenza virus-like particles in peripheral blood of immune mice

LINQiao，QIUYong-long，HOUXing-fang，etal.

Departmentofoutpatient，ShenzhenBao’anChronicDiseasesPreventandCureHospital，Shenzhen518126，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the regulating effects of tonic herbal compound on the IL-17A expression induced by influenza virus-like particles in peripheral blood. Methods42 BALB/C mice were divided into 7 groups(n= 6 for each group)，involving single VLPs group，VLPs combined Yiqi recipe，VLPs combined Buxue recipe，VLPs combined Ziyin recipe，and VLPs combined Zhuangyang recipe group，VLPs combined cholera toxin group was considered as positive control，and PBS only group was considered as blank control. The mice were immunized with 10μg VLPs each time through intranasal administration in day 0 and 14，and herbs were intragastric administration with 200 mg/Kg from first day to day 13. The blood was collected to make serum and PBMCs at pre-immunization and day 13 and day 28 after immunization. The IL-17A level in serum was determined by ELISA，and spot forming cells(SFCs)of IL-17A were determined using Elispot assay. Results(1)No matter in the early stage or late stage，influenza VLPs could induce IL-17A expression in serum，especially，Yiqi recipe could increase IL-17A level compared to single VLPs group(P<0.01).(2)Elispot technology can effectively detect the secretion of IL-17A positive cells in PBMCs. The SFCs of IL-17A was much higher in the Yiqi recipe and Ziyin recipe(P<0.01)，especially at day 28 after immunization. ConclusionYiqi recipe and Ziyin recipe can effectively increase IL-17A expression induced by influenza VLPs，which could be considered as new type adjuvants for influenza vaccine.

【Key words】Tonic herbal compound；Influenza；Virus-like Particles；IL-17A

(收稿日期：2016-02-02)

Corresponding author：LIN Qiao，E-mail：qlin021@aliyun.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.008

作者簡介：林巧(1978- )，碩士，副主任中醫(yī)師。研究方向：感染病中西醫(yī)結(jié)合診治研究。E-mail：qlin021@aliyun.com

基金項目：深圳市科技計劃(JCYJ20140411141712839)