AXL在胃癌中的表達及臨床意義

戴平 龍擁軍 孟培 王坤

·論 著·(臨床研究)

AXL在胃癌中的表達及臨床意義

戴平 龍擁軍 孟培 王坤

目的 檢測AXL及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關基因在胃癌中的表達與臨床意義，探索AXL介導的EMT在胃癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法 利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)技術檢測42例胃癌原發(fā)灶及癌旁組織中AXL核酸及蛋白的表達；采用免疫組化技術檢測AXL及EMT相關基因在102例胃癌原發(fā)灶及相應癌旁組織中的表達，統(tǒng)計分析AXL及EMT相關基因在胃癌原發(fā)灶中表達的相關性及與胃癌臨床病理特征之間的關系。結果 ①胃癌原發(fā)灶中AXL核酸及蛋白表達均高于其癌旁組織(P<0.001;P<0.001)；AXL、Slug及Vimentin在胃癌中的表達率分別顯著高于相應癌旁組織(58.8%比37.3%,P=0.002; 54.9%比38.2%,P=0.017; 56.9%比33.3%,P=0.001)；E-cadherin在胃癌中的表達率顯著低于相應的癌旁組織(39.2%比68.6%，P<0.001)。②胃癌原發(fā)灶中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin的表達高低分別與T分期(P<0.001;P=0.004;P<0.001;P<0.001)、TNM分期(P=0.023;P=0.023;P<0.001;P=0.022)及淋巴結轉(zhuǎn)移(P<0.001;P=0.002;P<0.001;P=0.005)有關。③在胃癌原發(fā)灶中，AXL的表達與Slug及Vimentin的表達呈正相關(r=0.323,P=0.001;r=0.317,P=0.001); AXL的表達與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.470,P<0.001)。④胃癌原發(fā)灶中AXL(P<0.001)、Slug(P<0.001)及Vimentin(P=0.009)陽性表達顯示預后不佳； Cox風險回歸多因素生存分析顯示，AXL陽性表達(P=0.022)、Slug陽性表達(P=0.004)及淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.029)是影響胃腺癌病人術后生存的獨立因素。結論 AXL在胃癌中高表達，在其發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，并可能通過介導EMT的發(fā)生促進胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

胃癌；AXL；E-cadherin；Slug；Vimentin

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第四位[1]，死亡率位居第二位[2]。胃癌已成為我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[3-4]。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移及復發(fā)是導致胃癌病人死亡的最主要原因，是影響臨床療效和預后的關鍵因素，但是其發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制尚不完全清楚。

腫瘤細胞具備侵襲能力以及從原發(fā)灶脫落是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關鍵。近年來國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用[5]。EMT是指上皮細胞形態(tài)改變和極性的喪失，細胞之間黏附能力減弱，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞，獲得遷移能力的一個過程，被認為在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關鍵的作用[6-7]，其特征包括上皮細胞表型分子如E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞表型分子如Vimentin及N-cadherin表達上調(diào)伴隨轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)[5,8]。近年來，研究證實EMT在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移及復發(fā)中同樣扮演了重要角色[9]。

AXL作為最新研究發(fā)現(xiàn)的一種受體酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases, RTKs)中的一員，在多種腫瘤中呈高表達，并參與其發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過程，可以通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄從而參與對腫瘤細胞黏附及遷移的調(diào)節(jié)[10]。Robison等[11]于1996年首先報道了前列腺癌組織中有AXL表達。此后諸多研究證實，AXL在多種腫瘤中呈高表達[12-16]，可以通過調(diào)控EMT的發(fā)生促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[12-15]。其中更有研究指出AXL可促進轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的激活并由此下調(diào)E-cadherin的表達引起EMT的發(fā)生從而導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強[12-13]。但目前國內(nèi)外針對AXL在胃癌中的相關報道較少，AXL在胃癌中作用以及參與作用的機制尚不清楚。本研究首先檢測AXL核酸及蛋白在胃癌中的表達情況，其次應用免疫組化技術檢測胃癌原發(fā)灶及癌旁組織中AXL和EMT相關基因的表達，結合臨床資料分析其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的意義，探討AXL和EMT在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關系并為進一步揭露其機制奠定基礎。

資料與方法

一、病例資料及組織樣本來源

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批后同意，選取我院普外科2010年2月至2013年2月期間收治的102例經(jīng)病理組織學檢驗確診為胃腺癌的病人作為研究對象，男性67例，女性35例；年齡37～84歲，中位年齡59歲；均行D2胃癌根治術(R0)。新鮮標本取自切除的胃癌原發(fā)灶或配對的距原發(fā)灶邊緣5 cm以上并獲得病理學檢查證實的正常胃黏膜組織。術中嚴格遵守無瘤原則，避免擠壓。所有病人術前均未行放療或化療。所有入組病例均經(jīng)病人或其家屬知情同意。生存隨訪截止時間為2015年5月，均采用電話或門診隨訪，隨訪率為86%。

二、主要試劑

兔抗人AXL多克隆抗體及Vimentin單克隆抗體均購自英國Abcam公司，兔抗人E-cadherin單克隆抗體及兔抗人Slug單克隆抗體均購自美國CST公司。RIPA裂解液購自上海碧云天公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Jackson公司；化學發(fā)光底物(enhanced chemiluminescence, ECL)試劑盒購自美國Thermo scientific公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自日本Takara公司；鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒購自武漢博士德公司。PBS緩沖液(pH 7.4)、二甲苯、枸櫞酸鹽抗原修復液、多濃度梯度酒精、過氧化氫等試劑均為上海市第一人民醫(yī)院寶山分院病理科提供。

三、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

取適量組織剪碎后置于研缽中研磨至粉末狀后，加入1 ml Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR反應。AXL引物序列：5’-GGCAACCCAGGGAATATCACA-3’和5’-ACACGAAGGTCTGATGTCCCA-3’；E-cadherin引物序列：5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3’和5’-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3’；Slug引物序列：5’-GGGGAGAAGCCTTTTTCTTG-3’和5’-TCCTCATGTTTGTGCAGGAG-3’；Vimentin引物序列：5’-CCAGGCAAAGCAGGAGTCCAC-3’和5’-GGCCATCTTAACATTGAGCAGGT-3’；GAPDH引物序列：5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3’和5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGG- 3’。 應用凝膠成像系統(tǒng)及凝膠圖像分析軟件行半定量分析目的產(chǎn)物與對應GAPDH產(chǎn)物的灰度值，目的mRNA表達水平以目的mRNA擴增條帶灰度值與GAPDH mRNA擴增條帶灰度值比值表示并分析。

四、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

取適量組織于研缽中研碎，加入150 μl裂解液冰上裂解30 min，獲取組織蛋白樣品。BCA法對蛋白進行定量。將樣品及蛋白質(zhì)分子量標準溶液行SDS-PAGE凝膠電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加一抗AXL抗體(1∶1000)、E-cadherin抗體(1∶1000)、Slug抗體(1∶1000)、Vimentin抗體(1∶1000)，4 ℃雜交過夜。膜漂洗后，HRP標記二抗IgG室溫孵育1 h(1∶5000)，漂洗后加ECL顯色。應用凝膠成像系統(tǒng)及凝膠圖像分析軟件分析目的產(chǎn)物與對應GAPDH產(chǎn)物電泳條帶的灰度值。目的蛋白表達水平以目的蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH電泳條帶灰度值比值表示并分析。

五、免疫組化染色

AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin蛋白檢測：標本經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，將石蠟包塊連續(xù)切片(以4 μm為厚度)。應用SABC法行免疫組化染色，染色步驟按試劑盒說明書進行。所有石蠟切片60 ℃烘箱中烘片30 min，依次二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸餾水沖洗后置入檸檬酸緩沖液中，微波加熱法高火7 min，低火10 min修復抗原。自然冷卻后，PBS沖洗，滴加5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫30 min后，甩去多余液體，不沖洗。滴加一抗(稀釋濃度為AXL為1∶100，E-cadherin為1∶400，Slug為1∶200，Vimentin為1∶300)后，置濕盒4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后滴加二抗，室溫孵育30 min。PBS沖洗后，滴加SABC，室溫孵育30 min，PBS沖洗后用DAB染色。DAB顯色后，蒸餾水沖洗，蘇木素復染3 min，鹽酸酒精分化。最后脫水、烘干、封片和顯微鏡下觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照，以試劑公司提供的已知陽性切片為陽性對照。

六、免疫組化染色評分

切片經(jīng)兩名病理科醫(yī)生在未知臨床病理資料情況下閱片評分，并協(xié)商取得統(tǒng)一。染色結果判定標準：①根據(jù)染色強度判定：無陽性染色為0分；淺黃色染色為1分；深黃色染色為2分；棕黃色染色為3分。②根據(jù)陽性細胞著色比率判定：0%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。最終以染色的評分和染色細胞所占比率的評分乘積作為每張切片的最終染色評分。0～3分視為陰性，>3分視為陽性。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胃癌組織和癌旁組織中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin表達的比較

應用RT-PCR和Western blot技術檢測42例胃癌組織及相應的癌旁組織中的AXL蛋白及核酸表達。結果表明，胃癌組織中AXL蛋白及核酸表達均顯著高于其相應的癌旁組織(P<0.05)。(圖1、2)應用免疫組化技術檢測102例胃癌組織及相應的癌旁組織中的AXL蛋白表達。染色結果表明，AXL、Slug及Vimentin在胃癌組織中均有廣泛表達，而E-cadherin在癌旁組織中廣泛表達(圖3)。102例胃癌組織標本中AXL的表達率為58.8%(60/102)，高于癌旁組織中的表達(P=0.002)。E-cadherin在胃癌組織中的表達率為39.2%(40/102)，明顯低于癌旁組織中的表達(P<0.001)。Slug在胃癌組織中的表達率為54.9%(56/102)，高于癌旁組織中的表達(P=0.017)。Vimentin在胃癌組織中的表達率為56.9%(58/102)，高于癌旁組織中的表達(P=0.001)。(表1)

圖1 胃癌原發(fā)灶組織及癌旁正常胃黏膜組織中AXL蛋白的表達

圖2 胃癌原發(fā)灶組織及癌旁正常胃黏膜組織中AXL核酸的表達

二、胃癌組織中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin表達與胃癌病人臨床病理間的關系(表2)

AXL、Slug及Vimentin在T3+T4期(T分期)、Ⅲ+Ⅳ期(TNM分期)及N1+N2+N3期(N分期)胃癌中的表達明顯高于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相反，E-cadherin在T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期及N1+N2+N3期胃癌中的表達明顯低于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是，AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin在胃癌組織中的表達與胃癌病人年齡、性別、腫瘤直徑、Lauren分型、血管浸潤和淋巴管浸潤等因素無關(P>0.05)。(表2)

表1 102例胃癌組織和癌旁組織中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin的表達[例(%)]

表2 胃癌組織中AXL、E-cadherin、Slug和Vimentin的表達與胃癌病人臨床病理特征間的關系

三、胃癌組織中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin表達的相關性

Spearman等級相關分析顯示，AXL與E-cadherin在胃癌組織中的表達呈負相關(r=-0.470，P<0.001)；AXL與Slug在胃癌組織中的表達呈正相關(r=0.323，P=0.001)；AXL與Vimentin在胃癌組織中的表達呈正相關(r=0.317，P=0.001)。(表3)

四、生存分析

Kaplan-Meier法生存分析顯示AXL、Slug和Vimentin陽性組生存時間小于陰性組生存時間，而E-cadherin陽性組生存時間大于陰性組生存時間，經(jīng)Log-rank法檢驗各組生存時間具有統(tǒng)計學意義(AXLP<0.001; SlugP<0.001; VimentinP=0.009; E-cadherinP<0.001)(圖4)。

表3 AXL、E-cadherin、Slug和Vimentin在胃癌組織中表達強度的相關性(例)

A.胃癌組織中AXL呈陽性表達;B.胃癌組織中E-cadherin呈陽性表達;C.胃癌組織中Slug呈陽性表達;D.胃癌組織中Vimentin呈陽性表達;E.癌旁正常胃黏膜組織中AXL呈陰性表達;F.癌旁正常胃黏膜組織中E-cadherin呈陽性表達;G.癌旁正常胃黏膜組織中Slug呈陰性表達;H.癌旁正常胃黏膜組織中Vimentin呈陰性表達圖3 胃癌原發(fā)灶及癌旁正常胃黏膜組織中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin蛋白的表達(SABC法,×200)

A.AXL陽性表達與AXL陰性表達的比較;B.E-cadherin陽性表達與E-cadherin陰性表達的比較;C.Slug陽性表達與Slug陰性表達的比較;D.Vimentin陽性表達與Vimentin陰性表達的比較圖4 胃癌原發(fā)灶中AXL、E-cadherin、Slug及Vimentin陽性表達組與陰性表達組胃腺癌病人生存曲線

Cox風險回歸多因素生存分析顯示，AXL陽性表達(P=0.022)、Slug陽性表達(P=0.004)及淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.029)是影響胃腺癌病人術后生存的獨立因素(表4)。

表4 Cox回歸模型多因素生存分析結果

討 論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，近年來盡管胃癌的早期診斷、手術方式及新輔助化療取得了一定的進步，但其5年生存率仍不足30%[16]。其預后不良的重要原因是局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，大部分胃癌確診時已是進展期，因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去根治性手術的機會，因此探索胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制及尋找其關鍵的基因，可為胃癌預后判斷及治療提供新的方向。

EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關，轉(zhuǎn)錄因子Slug在多種惡性腫瘤中下調(diào)上皮細胞標志物E-cadherin的表達，誘導EMT的發(fā)生[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Slug和Vimentin在胃癌原發(fā)灶組織中的表達均高于其相應的癌旁組織中的表達，并且與胃癌的T分期、pTNM分期及淋巴結轉(zhuǎn)移相關。此外，胃癌原發(fā)灶組織中Slug及Vimentin表達陽性，則病人5年生存率較低；而E-cadherin的結果正好與Slug和Vimentin相反，預示著EMT在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要的地位。

AXL其胞膜外區(qū)與神經(jīng)細胞黏附分子結構相似，胞質(zhì)區(qū)為酪氨酸激酶樣區(qū)，具有激酶活性。AXL因其特殊的結構，既有黏附分子的特點，又具有酪氨酸激酶的活性，在細胞的黏附與增殖中均有一定的作用[10]。Holland等[19]研究發(fā)現(xiàn)AXL通過基質(zhì)因子玻璃粘連蛋白調(diào)節(jié)新穎的內(nèi)皮細胞趨觸性遷移。Shieh等[20]研究證實，侵襲能力較高的肺腺癌細胞中AXL表達要顯著高于侵襲能力較低的肺腺癌細胞系；干擾AXL的表達，其細胞侵襲能力也隨之減弱，提示AXL的表達與肺腺癌細胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關。此外，Asiedu等[12]近期研究顯示，在乳腺癌中，AXL通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達促進EMT的發(fā)生，從而調(diào)控腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AXL核酸及蛋白在胃癌原發(fā)灶組織中的表達均高于其相應的癌旁組織中的表達，且胃癌原發(fā)灶組織中AXL的表達與胃癌的T分期、pTNM分期及淋巴結轉(zhuǎn)移相關；同樣，胃癌原發(fā)灶組織中AXL表達陽性，則病人5年生存率較低。此外，相關分析顯示胃癌中AXL的表達與Slug及Vimentin表達呈正相關，而與E-cadherin表達呈負相關。Cox風險回歸多因素生存分析顯示，AXL陽性表達亦是影響胃腺癌病人術后生存的獨立因素。因此，我們推斷胃癌組織中AXL表達的升高可促進Slug表達從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制E-cadherin表達，誘導Vimentin表達，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，AXL在胃癌原發(fā)灶中高表達，其表達水平與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關，AXL可能通過調(diào)控Slug誘導EMT的分子機制參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，AXL可能在胃癌形成、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，對AXL在胃癌組織中的表達檢測可能是預判胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的可行方法，并有望成為胃癌靶向治療的靶點。由此可知，針對胃癌中AXL表達的研究對胃癌的早期診斷、治療和預后具有重要意義，針對AXL的干擾措施將會為胃癌的治療提供新的研究方向和治療途徑，但是對AXL介導的EMT具體過程還有待于深入研究。

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Expression and significance of AXL in human gastric cancer

DaiPing,LongYongjun,MengPei,WangKun.

DepartmentofGeneralSurgery,BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200940,China.

DaiPing,Email:daiping999@126.com

Objective To investigate the clinical significance and expression of AXL and EMT-related proteins (E-cadherin, Slug and Vimentin) in human gastric cancer, and explore the role of AXL-mediated EMT in the development of gastric cancer.Methods The expression levels of AXL mRNA and protein in 42 cases were detected using RT-PCR and Western blotting respectively. And 102 cases were immunohistochemically examined for the expression of AXL and EMT-related proteins in primary lesion and adjacent normal gastric mucosas. The relationships between AXL and EMT-related proteins, as well as their correlations with clinicopathologic features and survival time were analyzed.Results (1)The AXL mRNA and proteins expression levels were increased in primary lesions as compared with adjacent normal gastric mucosas (bothP<0.001). The expression levels of AXL, Slug and Vimentin in primary lesions were significantly higher than those in adjacent normal gastric mucosas (58.8% vs. 37.3%,P=0.002; 54.9% vs. 38.2%,P=0.017; and 56.9% vs. 33.3%,P=0.001). E-cadherin showed significantly lower expression in primary lesions (39.2% vs. 68.6%,P<0.001).(2)The expression levels of AXL and EMT-related proteins were closely correlated with T stage (P<0.001;P=0.004;P<0.001;P<0.001), pTNM stage (P=0.023;P=0.023;P<0.001;P=0.022) and lymph node metastasis (P<0.001;P=0.002;P<0.001;P=0.005).(3)The expression level of AXL was positively related with that of Slug (r=0.323,P=0.001) and Vimentin (r=0.317,P=0.001), but negatively with E-cadherin expression (r=-0.470,P<0.001) in primary lesions.(4)Patients with gastric cancer positive for AXL-1 (P<0.001), Slug (P<0.001), or Vimentin (P=0.009) but negative for E-cadherin (P<0.001) had poorer prognosis. Cox analysis revealed that AXL-positive (P=0.022), Slug-positive (P=0.004) and lymph node metastasis (P=0.029) were the independent risk factors for survival time.Conclusions AXL played a critical role in the development of gastric cancer, and probably facilitated the invasion and metastasis of gastric cancer through the induction of EMT.

Gastric cancer; AXL; E-cadherin; Slug; Vimentin

200940 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院寶山分院普外科

戴平，Email:daiping999@126.com

R735.2

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10.3969/j.issn.1003-5591.2016.03.019

2015-11-23)