果蔬中殘留毒死蜱農(nóng)藥降解菌的選育及鑒定

孟慶林，梁金鐘，王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150076)

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果蔬中殘留毒死蜱農(nóng)藥降解菌的選育及鑒定

孟慶林，梁金鐘*，王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150076)

摘要為減少果蔬中殘留毒死蜱農(nóng)藥，從長(zhǎng)期噴灑有機(jī)磷農(nóng)藥的耕地土壤中，篩選到1株能高效降解毒死蜱農(nóng)藥的菌株并編號(hào)為DOP-Ma3。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果與GenBank上已提交的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)，由MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明該菌株與Burkholderia sp. 16S rDNA序列同源性達(dá)99%，確定其歸屬于伯克霍爾德菌屬。結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，確定此菌株為洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cenocepacia)。實(shí)驗(yàn)證明，該菌株在48 h對(duì)500 mg/L毒死蜱降解率為69.87%，其降解酶為胞外酶，在35 ℃、30 min、pH 7.0條件下，粗酶液添加量為10%，對(duì)250 mg/L的毒死蜱進(jìn)行降解，其降解率為52.47%。經(jīng)驗(yàn)證，該菌對(duì)氧化樂果、氯氰菊酯和敵百蟲也有一定的降解能力。

關(guān)鍵詞毒死蜱農(nóng)藥；降解菌；土壤；篩選；16S rDNA

我國(guó)蔬菜中的農(nóng)藥殘留十分普遍且比較嚴(yán)重[1-3]。國(guó)內(nèi)食用農(nóng)產(chǎn)品特別是果蔬等中的農(nóng)藥殘留污染已經(jīng)達(dá)到了相當(dāng)嚴(yán)重的程度，會(huì)對(duì)人們的健康造成損害[4-5]。目前市場(chǎng)上有機(jī)磷農(nóng)藥占有較大比重[6]，因而對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解就顯得比較重要[7]。

有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphates pesticides，簡(jiǎn)稱OPs)，主要的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，一般含有1個(gè)磷酰鍵(PO)或硫代磷酰鍵(PS)，構(gòu)成有機(jī)磷酸酯或硫代有機(jī)磷酸酯。其中，R1和R2直接與P原子結(jié)合，或通過S(O)原子與P原子相連，而吸電子的離去基團(tuán)X則直接或通過S(O)原子間接與P原子相連。當(dāng)此類殺蟲劑被磷酸酯酶水解時(shí)，X可從P原子上釋放離去，從而表現(xiàn)為解毒代謝作用[8]。

圖1　有機(jī)磷殺蟲劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of organophosphorous insecticides

毒死蜱(chlorpyrifos)作為世界廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥主要品種之一，其殘留問題引起大量國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注與研究。生物降解法具有安全、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，近年已報(bào)道的研究主要有高效降解微生物的篩選[9]、降解酶的種類與特性[10]、基因工程菌的構(gòu)建[11]、微生物表面展示技術(shù)[12]等。本實(shí)驗(yàn)旨在從土壤中篩選出野生高效降解毒死蜱農(nóng)藥的降解菌，對(duì)其進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其降解酶做初步研究，便于今后菌劑及酶制劑的制備。

1材料與方法

1.1材料與試劑

土壤，取自噴灑過農(nóng)藥的耕地土壤。

毒死蜱乳油(50 g/100 mL)，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；石油醚，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

DZP-102恒溫振蕩器，中國(guó)·哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；5100紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；723N可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；T100-PCR擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；JY5000電泳儀，北京市君意機(jī)電技術(shù)公司；SIM凝膠成像系統(tǒng)，百維信生物科技有限公司。

1.3培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基[13]：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，自然pH值。

選擇培養(yǎng)基[14]：MgSO4·7H2O 0.500 g/L、K2HPO41.310 g/L、FeSO4·7H2O 0.018 g/L、NaNO33.000 g/L、KCl 0.500 g/L。其中加入一定量的毒死蜱溶液作為唯一碳源。

1.4菌株篩選與鑒定

1.4.1菌株的初步篩選

取1 g土樣溶于10 mL生理鹽水中，搖勻后取上清液分別用生理鹽水梯度稀釋，并選取濃度為10-2、10-4、10-6分別涂布于加有50 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基平板中，35 ℃倒置培養(yǎng)48 h。將平板上所生長(zhǎng)的菌落分別挑至加有100 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基的96孔深孔板中，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，分別取0.1 mL菌液涂布于完全培養(yǎng)基平板中，35 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取單一菌落于200 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基的試管中，依次梯度增加毒死蜱濃度至10000 mg/L，以篩選到高耐藥性的菌株。

1.4.2毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

用紫外分光光度法[15]測(cè)定并繪制毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線：以石油醚作為毒死蜱的溶劑，配制200 mg/L毒死蜱溶液，在紫外分光光度計(jì)上全波長(zhǎng)掃描(200～700 nm)，確定最大吸收波長(zhǎng)。同樣將石油醚也進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果驗(yàn)證石油醚可為理想的毒死蜱溶劑。用石油醚分別配置0、5、10、20、30、40、50、75 mg/L的毒死蜱溶液，以石油醚調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定毒死蜱含量。根據(jù)所得的吸光度值與對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3高效降解菌的確定

將篩選出的幾株高耐藥性菌株分別接種于500、2 500、5 000、7 500、10 000 mg/L毒死蜱的液體選擇培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，分別搖勻后取發(fā)酵液適度稀釋，取5 mL稀釋后發(fā)酵液再用等體積石油醚萃取，在最大吸收峰處測(cè)其中毒死蜱殘留量[15]，計(jì)算降解率，以確定高效降解菌。

1.4.4菌株的鑒定

1.4.4.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株平板劃線觀察單菌落，挑取單菌落，涂片做革蘭氏染色后100倍油鏡鏡檢。菌液富集培養(yǎng)后離心收集菌體做電鏡掃描，觀察菌體形態(tài)。

1.4.4.2菌株的生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定[16]。

1.4.4.3菌株的分子生物學(xué)鑒定

用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)提取菌株的16S rDNA。

對(duì)菌株16S rDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增：反應(yīng)體系60 μL，模板(菌液)1.2 μL，正向引物(27FP6)1.2 μL，反向引物(1492R)1.2 μL，dNTPs 4.8 μL，Hifi Buffer 6.0 μL，Hifi酶0.6 μL，水定容至60 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃ 4 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠電泳[17]。

將DOP-Ma3的16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，并選取同源性較高的序列用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.5菌株的生長(zhǎng)曲線

將菌株DOP-Ma3按2%接種量接種于完全液體培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h取樣并在600 nm處測(cè)定培養(yǎng)基中菌的吸光度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.6毒死蜱降解酶的細(xì)胞定位

分別將菌DOP-Ma3接種于液體完全培養(yǎng)基與加50 mg/L毒死蜱的液體完全培養(yǎng)基，35 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，分別取菌液30 mL于離心管中，8 000 r/min離心10 min，分離上清液與沉淀，并分別用石油醚清洗2～3次后，上清液即為胞外粗酶液。沉淀用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至3 mL，細(xì)胞冰水浴并超聲波破碎，功率400 W、工作5 s、間歇15 s、工作40次，12 000 r/min離心2 min，取上清液為胞內(nèi)粗酶液[19]。分別取胞內(nèi)與胞外粗酶液0.5 mL于5 mL事先用磷酸鹽緩沖液配制的250 mg/L毒死蜱底物中。35 ℃水浴反應(yīng)30 min后加入1 mol/L HCl 0.5 mL終止反應(yīng)?？瞻讟右运娲置敢?。于紫外分光光度計(jì)中測(cè)其在最大吸收峰處的吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出底物中毒死蜱殘留量，按公式(1)計(jì)算降解率：

(1)

式中：R為粗酶液降解率，%；ρ為空白樣吸光度值；ρ1為反應(yīng)后底物吸光度值；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線中斜率。

2結(jié)果與分析

2.1毒死蜱降解菌的篩選與鑒定

2.1.1高耐毒死蜱的菌株的篩選

通過選擇培養(yǎng)基從土壤中獲得200多株耐藥性菌株，經(jīng)梯度增加培養(yǎng)基中毒死蜱濃度至1 000 mg/L，最終獲得6株高耐菌株。

2.1.2毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.2.1測(cè)量方法的驗(yàn)證

以水為基線，將石油醚配置的100 mg/L毒死蜱標(biāo)樣，與石油醚分別在紫外分光光度計(jì)下全波長(zhǎng)(200～700 nm)掃描，得出毒死蜱與石油醚的吸收光譜曲線，結(jié)果見圖2與圖3。

圖2　毒死蜱的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.2　The ultra-violet absorption picture of chlorpyrifos

圖3　石油醚的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.3 The ultra-violet absorption picture of petroleum ether

如圖2與圖3所示，毒死蜱在293 nm處有明顯的特殊吸收峰，而石油醚在此處無明顯特殊吸收峰，故可用石油醚為毒死蜱的萃取劑并在293 nm處測(cè)毒死蜱濃度。

2.1.2.2毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)(x)、以毒死蜱在293 nm處吸光值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4。顯示在0～80 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y= 0.0204x+ 0.021，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。

圖4　毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　The standard curve of chlorpyrifos

2.1.3高效降解毒死蜱菌株的篩選(復(fù)篩)

分別將初篩所得6株高耐菌以2%接種量轉(zhuǎn)接于500、2 500、5 000、7 500、10 000 mg/L毒死蜱質(zhì)量濃度的選擇培養(yǎng)基， 35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后取樣，適量稀釋后以石油醚萃取，在293 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算降解率，如圖5。最終確定1株高效降解菌并編號(hào)為DOP-Ma3。

圖5　不同菌株對(duì)毒死蜱降解率比較Fig.5　Comparisons of degradation rate of chlorpyrifos among different strains

2.1.4菌株的鑒定

2.1.4.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

分別用肉眼(圖6)和4倍光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察完全培養(yǎng)基平板上的DOP-Ma3單菌落形態(tài)，菌落呈乳黃色圓形小點(diǎn)狀，邊緣整齊且半透明，中心微凸起。在試管液體培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)于液體表面，為好氧菌。經(jīng)革蘭氏染色后用100倍油鏡觀察，菌為革蘭氏陰性菌(G-)，長(zhǎng)點(diǎn)狀或短桿狀。再經(jīng)S-3400N掃描電鏡(圖7)觀察可清楚看到DOP-Ma3為(0.4～0.6) μm×(1.0～1.2) μm短桿菌。

圖6　菌落形態(tài)Fig.6　Colonies of strain DOP-Ma3

2.1.4.2菌株的生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，將菌DOP-Ma3分別接種于生理生化管與相

圖7　掃描電鏡Fig.7　SEM of strain DOP-Ma3

應(yīng)的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后觀察現(xiàn)象(結(jié)果見表1)。精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基未出現(xiàn)變色現(xiàn)象，結(jié)果為陰性；反硝化作用實(shí)驗(yàn)中，大試管中小試管未收集到氣體，結(jié)果為陰性；水解淀粉實(shí)驗(yàn)中，平板中滴加碘液后變?yōu)樗{(lán)黑色，菌落周圍無透明圈，結(jié)果為陰性；明膠液化實(shí)驗(yàn)，接菌培養(yǎng)后的培養(yǎng)基經(jīng)4 ℃冷凍10 min后于對(duì)照相比有明顯的液化現(xiàn)象，結(jié)果為陽(yáng)性。

表1　生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)。

由表1可知，菌株DOP-Ma3可以利用葡萄糖、D-木糖、D-核糖、乙酰丙酸鹽、檸康酸鹽、中酒石酸鹽、2,3-丁二醇、間羥基苯甲酸鹽、色胺、戊胺為碳源；但L-鼠李糖、中康酸鹽、D-酒石酸鹽、赤蘚糖醇不能利用。最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃。

2.1.4.3菌株的分子生物學(xué)鑒定

將提取的16SrDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后與Mark同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果與Mark對(duì)比大小為1 500 bp左右。

圖8　 菌株DOP-Ma3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8　Phylogenetic tree of strain DOP-Ma3

所得序列經(jīng)NCBI上已公布序列BLAST比對(duì)，將同源性99%的序列利用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining法制作系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖8可知，所篩菌株DOP-Ma3與已知菌伯克霍爾德菌屬同源性均達(dá)99 %，確定其為伯克霍爾德菌屬(Burkholderasp.)，結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定菌株DOP-Ma3為洋蔥伯克霍爾德菌(BurkholderacenocepaciaDOP-Ma3)。GenBank上登錄號(hào)為KT993571。

2.2菌株的生長(zhǎng)曲線

將菌株DOP-Ma3接種于種子培養(yǎng)基中，每?jī)尚r(shí)測(cè)定其OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，如圖9。

圖9　菌株DOP-Ma3的生長(zhǎng)曲線Fig. 9　Growth curves of strain DOP-Ma3

由圖9可見，在完全培養(yǎng)基中菌株DOP-Ma3適應(yīng)期短，生長(zhǎng)迅速，12 h后生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定。

2.3毒死蜱降解酶位置的確定

分別提取胞外粗酶液與胞內(nèi)粗酶液對(duì)50 mg/L毒死蜱底物進(jìn)行降解后，在OD293處測(cè)毒死蜱殘留量并計(jì)算降解率，結(jié)果見表2。

表2　毒死蜱降解酶位置的確定

表2顯示，胞外粗酶液對(duì)250 mg/L毒死蜱底物的降解明顯，而胞內(nèi)粗酶液對(duì)底物降解幾乎為0，初步斷定菌降解酶為胞外酶。且未添加毒死蜱的完全培養(yǎng)基中所提胞外粗酶液表現(xiàn)較高降解力，證明該菌株所產(chǎn)降解酶無需毒死蜱為誘導(dǎo)物。加有50 mg/L毒死蜱的發(fā)酵液中粗酶液降解率較低，可能是培養(yǎng)基中毒死蜱對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降，含量降低。

3結(jié)論

生物降解作為一種經(jīng)濟(jì)、高效、無污染的降解果蔬中農(nóng)藥殘留的方法，具有廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選到200多株毒死蜱降解菌，經(jīng)復(fù)篩后獲得一株高耐藥性且高降解能力的菌株，經(jīng)生理生化與分子生物學(xué)鑒定，最終確定其為洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)，編號(hào)為DOP-Ma3。該菌株具有良好的耐藥性，其對(duì)毒死蜱農(nóng)藥的最高耐受度達(dá)10 000 mg/L，而且對(duì)氧化樂果、氯氰菊酯和敵百蟲具有降解能力和耐受力，說明具有一定的廣譜性。菌株DOP-Ma3為野生菌株未經(jīng)誘變，48 h對(duì)250 mg/L毒死蜱的降解率為69.87%，與已報(bào)道的Rhodopseudomonassp.(紅假單胞菌)[20]、Brevibacteriumhalotolerans(耐鹽短桿菌)[21]、Bacilluscereus(蠟狀芽孢桿菌)等相比有一定優(yōu)勢(shì)。所產(chǎn)降解酶為胞外酶且無需毒死蜱誘導(dǎo)，便于后期酶的提取與精制。今后可通過工藝條件優(yōu)化和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步提高降解酶產(chǎn)量與酶活力，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究。另外，該菌株還具有一定的生物防治作用[22]，既能減少果蔬表面殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥又能對(duì)果蔬生物防腐，利于果蔬貯藏。

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Screening and identification of bacteria for the degradation of residues chlorpyrifos pesticide on fruits and vegetables

MENG Qing-lin, LIANG Jin-zhong*, WANG Feng-qing

(Key Laboratory for Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Heilongjiang Province, Harbin 150076, China)

ABSTRACTIn order to reduce the chlorpyrifos pesticide residues on fruits and vegetables, a strain with high efficient degrading ability for chlorpyrifos pesticide was isolated from?the arable soil sprayed with organophosphorus pesticide and named DOP-Ma3. Morphology analysis was carried out and the phylogenetic tree was generated by MEGA 6.0 software after comparison with homologous 16S rDNA sequences from GenBank. Results showed that it was closely related to Burkholderia sp. with 99% of 16S rDNA sequence homology. Based on the results of physiological and biochemical identification, the strain was determined as Burkholderia cenocepacia. The degradation rate of DOP-Ma3 was 69.87% for 500 mg/L chlorpyrifos in 48 h. The degrading enzyme was extracellular enzyme. The degradation rate of 10% fermentation broth for 250 mg/L chlorpyrifos was 52.47% after degradation at 35 ℃, pH 7.0 for 30 min. It was proved that this bacteria also possessed the ability to degrade omethoate, cypermethrin, and dipterex.

Key wordschlorpyrifos pesticide; degradation bacteria; soil; isolated; 16S rDNA

收稿日期：2015-11-02，改回日期：2016-01-01

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604020

第一作者：碩士研究生(梁金鐘教授為通訊作者，E-mail:Ljz2050@126.com)。