亞油酸對(duì)食品加工中晚期糖基化終產(chǎn)物的影響

劉玲，岳璐，趙鑫，康世墨

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)

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亞油酸對(duì)食品加工中晚期糖基化終產(chǎn)物的影響

劉玲*，岳璐，趙鑫，康世墨

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)

摘要研究一種不飽和脂肪酸——亞油酸對(duì)糖基化反應(yīng)體系主要中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物的作用，探討在食品加工中不飽和亞油酸對(duì)晚期糖基化產(chǎn)物的影響。建立亞油酸、D-葡萄糖和L-賴氨酸反應(yīng)的微乳體系，采用紫外-可見吸光光度法檢測(cè)中間產(chǎn)物乙二醛、丙二醛和果糖胺的生成量；熒光法檢測(cè)戊糖素和熒光性晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)的生成量；高效液相色譜法檢測(cè)終產(chǎn)物羧甲基賴氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]的生成量，分別比較各生成產(chǎn)物的變化，探討亞油酸對(duì)反應(yīng)途徑的影響。結(jié)果顯示：從中間產(chǎn)物上看，亞油酸能有效參與羰胺的糖基化反應(yīng)，提高中間產(chǎn)物乙二醛含量，增加丙二醛含量，減少果糖胺的生成；從終產(chǎn)物來看，亞油酸的存在對(duì)戊糖素的生成量影響不明顯，但能明顯抑制羧甲基賴氨酸的形成并抑制熒光性AGEs的累積。在糖基化反應(yīng)體系中亞油酸的存在一方面能夠氧化葡萄糖，使參與羰胺反應(yīng)的葡萄糖減少；另一方面因氧化促進(jìn)了乙二醛等活性醛的生成，從而加速乙二醛與賴氨酸之間的反應(yīng)，減少了參與羰胺反應(yīng)的賴氨酸含量；亞油酸參與反應(yīng)使中間產(chǎn)物丙二醛含量增加，進(jìn)而增加了羧甲基賴氨酸同源的羧乙基賴氨酸(CEL)的生成量，減少了非熒光性產(chǎn)物羧甲基賴氨酸和熒光性AGEs生成量。

關(guān)鍵詞亞油酸；晚期糖基化終產(chǎn)物；羰胺反應(yīng)；糖基化反應(yīng)

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是食品加熱或貯藏過程中，還原糖的羰基和蛋白質(zhì)或多肽中氨基及游離氨基酸經(jīng)縮合和聚合反應(yīng)生成類黑色素的反應(yīng)，又稱“羰胺反應(yīng)”。其中，晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)是其生成的一類穩(wěn)定、不可逆的化合物[1-3]，可通過人體膳食進(jìn)入體內(nèi)。大量研究表明，AGEs可引起蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、溶解性等性質(zhì)發(fā)生改變。當(dāng)人體內(nèi)AGEs累積時(shí)，可引起粥樣動(dòng)脈硬化、心血管疾病、糖尿病、尿毒癥、阿爾茨海默癥等[4-9]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，食品具有較多的營(yíng)養(yǎng)成分在加工中易形成AGEs，特別是在高脂和高蛋白食品中[10]。

AGEs不是單一產(chǎn)物，包括20多種。其中一些是有熒光性的交聯(lián)產(chǎn)物，一些是非熒光性物質(zhì)。其中，羧甲基賴氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]是糖基化反應(yīng)中的重要產(chǎn)物，是AGEs最主要的成分之一[11]，無(wú)熒光性，常被看作是檢測(cè)食品中AGEs含量的主要目標(biāo)產(chǎn)物[12]。戊糖素是一種具有熒光的蛋白交聯(lián)物質(zhì)，主要是戊糖和L-賴氨酸、精氨酸通Amadori重排繼后脫水和氧化斷裂而產(chǎn)生，在葡萄糖和氨基酸的反應(yīng)中也少量產(chǎn)生[13]。果糖胺作為美拉德糖基化反應(yīng)的早期產(chǎn)物，是衡量美拉德反應(yīng)的主要指標(biāo)[14]。乙二醛(glyoxal，GO)是糖基化反應(yīng)的前期重要產(chǎn)物，其糖化性能比葡萄糖高約20 000倍，是生成AGEs的重要前體物質(zhì)[15]。丙二醛(methylglyoxal，MGO)是乙二醛的同系物，與乙二醛很類似可通過糖基化反應(yīng)經(jīng)阿瑪多利重排生成[16]。

目前關(guān)于食品中AGEs的研究多限于對(duì)CML生成路徑或含量，其中，韓立鵬研究了含脂食品中羧甲基賴氨酸的生成路徑[17]；卞偉華等分析了國(guó)內(nèi)常見食品中CML的含量[18]，但關(guān)于含脂類食品中AGEs形成機(jī)理的深入研究鮮有報(bào)道。本文以C18∶2不飽和脂肪酸(亞油酸)為代表，,檢測(cè)并分析不同反應(yīng)時(shí)間4種中間產(chǎn)物GO、MGO、果糖胺、戊糖素的含量以及主要終產(chǎn)物CML和AGEs的含量以其變化，探究亞油酸在食品加工中對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物生成的主要影響。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑

L-賴氨酸，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Span 80，Genview公司；Tween 20，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞油酸，上海瑞永生物科技有限公司；正丁醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

磁力攪拌器(ZNCL-B)，北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)(722)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；熒光分光光度儀(F-4600)，日立公司；高效液相色譜儀(Prominence LC-20AB)，島津公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1L-賴氨酸和D-葡萄糖含脂美拉德微乳體系的制備

取適當(dāng)比例Span 80、Tween 20與少量正丁醇，磁力攪拌器攪拌均勻。加入1.0 g亞油酸并將0.2 mol/L的L-賴氨酸與0.6 mol/L的D-葡萄糖以1∶3的質(zhì)量比加入，將上述體系溶解在pH 8.0的磷酸緩沖液(PBS)中，作為含脂美拉德反應(yīng)體系(簡(jiǎn)稱含脂體系)。以L-賴氨酸與D-葡萄糖反應(yīng)的美拉德體系(簡(jiǎn)稱非脂體系)為對(duì)照，在溫度為60 ℃水浴鍋中分別反應(yīng)0～40 h。平行反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3.2早期糖基化產(chǎn)物GO的測(cè)定

分別取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各組反應(yīng)樣液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入1 500.0 mg/L乙酸鈉溶液1.0 mL、2 000.0 mg/L鹽酸羥胺溶液2.0 mL。50 ℃水浴加熱20 min，冷卻后用蒸餾水定容，測(cè)定233 nm處紫外吸光值。平行反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3.3早期糖基化產(chǎn)物MGO的測(cè)定

分別取反應(yīng)液1.0 mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)0.5%硫代巴比妥酸溶液5.0 mL，搖勻，放入水浴中煮沸10 min后取出冷卻。再使用離心機(jī)3 000 r/min分離提取液15 min，取上層清液。以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白，測(cè)定450、534和600 nm處吸光值。

C(MGO) = 6.45(D532-D600) -0.56D450

1.3.4早期糖基化產(chǎn)物果糖胺的測(cè)定

硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原法。分別取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各組反應(yīng)樣液40.0 μL，加0.025 mol/L NBT試液2.0 mL。35 ℃反應(yīng)5 min，以10%醋酸溶液中止反應(yīng)，測(cè)定530 nm處的紫外吸光值。平行反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3.5戊糖素的測(cè)定

分別取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各組反應(yīng)樣液0.1 mL于小試管中，用PBS緩沖液稀釋30倍，在激發(fā)波長(zhǎng)335 nm，發(fā)射波長(zhǎng)385 nm處測(cè)定熒光值。平行反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3.6糖基化產(chǎn)物 CML 的測(cè)定

采用HPLC檢測(cè)糖基化反應(yīng)體系中CML的生成量。分別取反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h的各組反應(yīng)樣液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取10 μL加入高效液相色譜儀，非脂體系為對(duì)照組。平行反應(yīng)重復(fù)3次。

高效液相色譜法條件：色譜柱：WatersAtlantisT3 C18色譜柱(150 mm Atlant 5 μm)；流動(dòng)相：V(體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)∶V(甲醇)=70∶30；流動(dòng)相流速 0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：10 min。

1.3.7熒光性 AGEs 的測(cè)定

分別取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各組反應(yīng)樣液0.1 mL于小試管中，非脂體系為對(duì)照組，用PBS緩沖液稀釋30倍，在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處測(cè)定熒光值。

1.3.8數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 13.0軟件數(shù)據(jù)分析；采用Origin 8.0軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1兩體系中GO生成量的變化

由圖1可知，在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)兩體系GO的含量均成上升趨勢(shì)，但含脂體系中GO的含量明顯高于非脂體系(P<0.01)。說明亞油酸可能參與到糖基化反應(yīng)中，經(jīng)羰胺反應(yīng)生成GO；或亞油酸自身氧化而產(chǎn)生羰基化合物，進(jìn)而生成GO[19]。

圖1　乙二醛生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.1　Production of theglyoxal with reaction time

2.2兩體系MGO生成量的變化

由圖2可見，兩體系MGO生成量的變化趨勢(shì)基本一致。0～10 h MGO生成量逐漸減少，10～40 h MGO含量持續(xù)增加，在反應(yīng)過程中含脂體系MGO的含量始終高于非脂體系的含量。這說明亞油酸糖基化反應(yīng)生成GO的同時(shí)還生成了MGO。MGO是羧乙基賴氨酸(CEL)的重要前體物質(zhì)，其含量的升高意味著CEL的累積[20]。

圖2　丙二醛生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.2　Production of the methylglyoxal with reaction time

2.3兩體系果糖胺生成量的變化

由圖3可見，2種反應(yīng)體系中果糖胺的生成變化趨勢(shì)相同，即含量先隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，15 h后逐漸下降，后期迅速上升。這說明在果糖生成一定時(shí)間后，因逐步參與美拉德中末期反應(yīng)而消耗，吸光值呈下降趨勢(shì)；20 h后可能隨終末期反應(yīng)產(chǎn)物的累積，后期反應(yīng)速度減慢，果糖胺逐漸累積，吸光值回升。

圖3　果糖胺生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.3　Production of the fructosamine with reaction time

在反應(yīng)的整個(gè)過程中，含脂體系中的果糖胺生成量顯著(P<0.01)低于非含脂體系，這是因?yàn)閬営退岬膮⑴c導(dǎo)致反應(yīng)途徑的變化。一方面是亞油酸和D-葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)性地與L-賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，使賴氨酸與D-葡萄糖之間的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物減少，果糖胺生成量減少；另一方面，由于油脂本身逐步氧化，造成D-葡萄糖隨之氧化，從而生成活性醛類產(chǎn)物[21]，不再經(jīng)美拉德反應(yīng)途徑生成果糖胺，這樣也造成了果糖胺生成量的減少。

2.4兩體系戊糖素生成的變化

戊糖素主要是戊糖和賴氨酸、精氨酸生成的，葡萄糖在有氧條件下可以少量的生成。戊糖素含量可視為評(píng)估糖基化過程中蛋白質(zhì)損傷的重要參數(shù)[22]。從圖4可見，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，兩體系中戊糖素的含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，說明在加工中戊糖素的生成量存在最大值點(diǎn)，但含量不高。兩體系中產(chǎn)生的戊糖素含量差別不大，這說明亞油酸的參與對(duì)戊糖素的生成影響不大。

圖4　戊糖素生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.4　Production of the pentosidine with reaction time

2.5兩體系CML生成量的變化

0～40 h反應(yīng)體系中主要產(chǎn)物CML含量的變化見圖5，以CML含量測(cè)定的吸收峰表征。從圖5中可以看出，0～10 h內(nèi)含脂體系CML的生成量略低于非含脂體系的含量，但兩體系含量都保持著緩慢上升的趨勢(shì)。從10 h開始，含脂體系與非含脂體系CML的含量差異逐漸明顯，但都以較快的速度增長(zhǎng)。反應(yīng)至32 h非脂體系比含脂體系CML含量多50%，40 h反應(yīng)至末期時(shí)，2種體系內(nèi)CML的含量逐漸接近。

圖5　CML生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.5　Production of the CML with reaction time

CML含量在兩體系中變化的原因考慮主要有2個(gè)方面。一方面，亞油酸參與糖基化反應(yīng)的同時(shí)也在進(jìn)行自身氧化，其氧化產(chǎn)物乙二醛等二羰基化合物與L-賴氨酸生成乙二醛-L-賴氨酸二聚體和其他二聚體，使參與生成CML的L-賴氨酸量減少，導(dǎo)致含脂體系CML的含量比非脂體系少；另一方面，從圖2可見，含脂體系產(chǎn)生MGO的含量高于非脂體系。MGO可進(jìn)一步通過阿瑪多利重排生成CML的類似物CEL[23-24]，因此含脂體系生成的CEL多于非脂體系，而CML含量低于非脂體系。

2.6兩體系熒光性AGEs生成量的變化

由圖6可知，反應(yīng)0～8 h期間，含脂體系中AGEs的生成量高于非脂體系，并處于迅速上升階段；8～40 h后非脂體系中AGEs的生成量緩速升高，非脂體系A(chǔ)GEs含量明顯高于含脂體系。

圖6　熒光性AGEs生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.6　Production of the fluorescence AGEs with reaction time

與含脂體系中CML的含量低于非含脂體系原因類似，由于亞油酸除了參與美拉德反應(yīng)直接生成AGEs之外，還能夠生成一些活性的羰基化合物，這些羰基化合物能夠與L-賴氨酸反應(yīng)進(jìn)一步反應(yīng)生成AGE，也能經(jīng)聚合反應(yīng)生成乙二醛-L-賴氨酸二聚體，丙二醛-L-賴氨酸二聚體等無(wú)熒光物質(zhì)[25]，這些聚合物在反應(yīng)中期的逐漸生成消耗了L-賴氨酸，使得含脂體系中參與羰胺反應(yīng)的賴氨酸減少，故羰胺反應(yīng)進(jìn)行緩慢[26]，羰胺化合物產(chǎn)生量較少，導(dǎo)致含脂體系比非含脂體系后期生成AGEs的含量減少。

3結(jié)論

通過建立亞油酸、D-葡萄糖和L-賴氨酸的含脂微乳模擬體系，分析早、中期產(chǎn)物果糖胺和乙二醛、丙二醛和主要產(chǎn)物戊糖素、非熒光性產(chǎn)物CML和熒光性AGEs含量的變化，探討亞油酸對(duì)糖基化反應(yīng)的影響。經(jīng)含脂和非脂體系的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，亞油酸促進(jìn)乙二醛和丙二醛合成量，減少果糖胺的生成，對(duì)戊糖素的生成量影響不明顯，對(duì)CML的生成具有抑制作用，減少熒光性AGEs生成。結(jié)果表明，油脂的存在一方面氧化賴氨酸，使參與羰胺反應(yīng)的賴氨酸減少，進(jìn)而減少了非熒光性產(chǎn)物CML和熒光性AGEs生成。另一方面亞油酸的氧化增加了乙二醛等活性醛的生成，促進(jìn)了乙二醛與賴氨酸之間的反應(yīng)，減少了參與羰胺反應(yīng)的賴氨酸；同時(shí)亞油酸使丙二醛的生成量增加，進(jìn)而增加CEL生成量，導(dǎo)致CML的含量和AGEs含量減少。

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Effects of linoleic acid on intermediate and final product in glycosylation in food processing

LIU Ling*, YUE Lu, ZHAO Xin, KANG Shi-mo

(Food College of Shenyang Agricultural Uinversity，Shenyang 110866， China)

ABSTRACTThe effect of an unsaturated fatty acid-linoleic acid on main intermediate products and final products in glycosylation reaction was studied. A microemulsion system of linoleic acid, D-glucose and L-lysine was established. Intermediate products including glyoxal, malondialdehyde and fructosamine were detected by UV spectrophotometry. The pentose and fluorescence AGEs were determined by the fluorescence spectrophotometry. One of the end product, carboxymethyl lysine (CML) was detected by high performance liquid chromatography (HPLC). Then these products were compared and the effect of linoleic acid on the reaction pathway was further elucidated. Linoleic acid can effectively participate in the glycosylation reaction in the intermediate products; it increased the content of glyoxal and malondialdehyde, and reduced generating of fructosamine. In the final products, the effect of linoleic acid to pentosidine formation is not obvious, but linoleic acid significantly inhibited CML formation and inhibited fluorescent AGEs accumulation. Linoleic acid oxidized glucose, which decreased content in carbonyl amine reaction; On the other hand, oxidation promoted the formation of glyoxal and some other reactive aldehydes, thus accelerated the reaction between glyoxal and lysine. Furthermore, the lysine content was decreased in carbonyl amine reaction; malondialdehyde content was increased after adding linoleic acid into reaction, CEL content was increased, and the content of CML and fluorescence AGEs were reduced.

Key wordslinoleic acid; advanced glycation end products; carbonyl amine reaction; glycosylation

收稿日期：2015-07-17，改回日期：2015-10-21

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014027003)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604015

第一作者：博士，副教授(本文通訊作者，E-mail:1210197616@qq.com)。