紅細(xì)胞包載丹參酮ⅡA磺酸鈉的制備及其性能考察

●董曉婷 牛亞偉 王悅敏 趙嘉蘭 秦凌浩

紅細(xì)胞包載丹參酮ⅡA磺酸鈉的制備及其性能考察

●董曉婷 牛亞偉 王悅敏 趙嘉蘭 秦凌浩

目的：制備載藥紅細(xì)胞（STS-RBCs），并對(duì)其載藥參數(shù)和生物學(xué)特性進(jìn)行考察。方法：采用低滲預(yù)膨脹-等滲重封閉法制備STS-RBCs。采用高效液相色譜法測(cè)定其載藥量。通過(guò)單因素考察法，篩選出載藥最佳條件。通過(guò)考察STS-RBCs的離心穩(wěn)定性，湍流穩(wěn)定性，儲(chǔ)存穩(wěn)定性，光照穩(wěn)定性以及體外溶血情況對(duì)其穩(wěn)定性和安全性進(jìn)行考察。采用顯微鏡觀察STS-RBCs和正常紅細(xì)胞的形態(tài)。采用透析法，對(duì)載藥紅細(xì)胞體外釋放進(jìn)行考察。結(jié)果：選擇62%×PBS（pH7.4）作為預(yù)膨脹工作液。最佳載藥量為67.05±6.94%。在37℃，STS濃度（溶劑為62%×PBS）1mg/ml，藥物與壓積紅細(xì)胞體積比2：1時(shí)，載藥量最高。STS-RBCs在3000rpm以下時(shí)，離心穩(wěn)定性良好，湍流穩(wěn)定性好，體外溶血實(shí)驗(yàn)合格，RBCs作為藥物載體對(duì)STS有光照保護(hù)作用。在4℃保存情況下，5天內(nèi)穩(wěn)定。體外釋放可持續(xù)48h以上，且無(wú)突釋現(xiàn)象。結(jié)論：紅細(xì)胞可以作為STS的載體。

紅細(xì)胞；丹參酮ⅡA磺酸鈉；載藥量；體外釋放；體內(nèi)釋放

丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）是丹參酮ⅡA的磺酸化產(chǎn)物。大量實(shí)驗(yàn)證明，STS具有保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用，以及降低心肌梗死大小的優(yōu)點(diǎn)[1]。此外，幾項(xiàng)研究表明STS具有抗炎的優(yōu)點(diǎn)，減少了急性心肌梗死誘導(dǎo)的左心室重塑，促進(jìn)血管生成[2]。然而，STS的半衰期較短，近年來(lái)紅細(xì)胞作為藥物載體的研究頗為豐富，因此本實(shí)驗(yàn)采用紅細(xì)胞作為STS的載體，并對(duì)其進(jìn)行一系列性質(zhì)研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

FA1104N分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C酸度計(jì)（上海儀電科技儀器股份有限公司）；Hitachi Chromaster系列高效液相色譜儀（5110四元泵，5310柱溫箱，5410紫外檢測(cè)器，5210自動(dòng)進(jìn)樣器，日本日立高新技術(shù)公司）；T6型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；顯微鏡（Carl Zeiss,德國(guó)）

1.2 試劑

丹參酮IIA磺酸鈉原料藥（西安昊軒生物科技有限公司）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司）；紅細(xì)胞裂解液，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；甲醇，乙腈（J.T.Barker，色譜純）；二甲基亞砜（DMSO），磷酸二氫鈉，磷酸（廣州化學(xué)試劑廠，分析純）1×PBS，10×PBS，HyClone；

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC方法測(cè)定STS含量

采用HPLC法進(jìn)行相關(guān)的含量測(cè)定。色譜條件：C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），以磷酸鹽緩沖液（pH3.5）—乙腈（40∶60）為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量為20μl。

取20μl STS-RBCs，加入980μl紅細(xì)胞裂解液于4℃振搖孵育15min，充分裂解后混勻，取20ul裂解液，加入3980ul甲醇，渦旋3min，10000rpm離心10min，取上清，HPLC分析其STS含量。

2.2 壓積紅細(xì)胞的提取分離

SD大鼠眼靜脈叢取血，將新鮮血液置于經(jīng)肝素鈉潤(rùn)濕的離心管中，2000rpm離心10min，棄上清和白細(xì)胞層。4倍體積PBS（pH7.4）洗滌三次，棄上清得壓積紅細(xì)胞。取1體積壓積紅細(xì)胞與4體積不同梯度濃度的PBS低滲液混勻，4℃振搖孵育15min，2000rpm離心10min，取可見(jiàn)溶血前一濃度溶液作為低滲預(yù)膨脹工作液。

2.3 STS-RBCs的制備

取0.5ml壓積紅細(xì)胞，加入2ml預(yù)膨脹工作液于37℃下不斷振搖孵育15min后，2000rpm離心10min，定量棄去1.5ml上清。加入1ml濃度為1mg/ml的丹參酮IIA磺酸鈉低滲預(yù)膨脹工作液溶液，37℃下不斷振搖孵育1h。加入42μl濃縮液于37℃下不斷振搖孵育1h，使其恢復(fù)等滲條件。2000rpm離心10min，定量吸取1.2ml上清，加入3.2mlPBS，充分混勻后，2000rpm離心10min。重復(fù)操作三次，充分棄去游離STS。其中預(yù)膨脹工作液的選擇通過(guò)篩選50%，52%，54%，56%，58%，60%，62%，64%， 66%，68%作為預(yù)膨脹溶液，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在62%×PBS中不發(fā)生可見(jiàn)溶血，在60%×PBS中發(fā)生可見(jiàn)溶血，因此選擇62%×PBS為預(yù)膨脹工作液。

10×PBS濃縮液加入體積根據(jù)以下公式計(jì)算。

V：10×PBS濃縮液加入體積 V1：預(yù)膨脹液體積 C1：等滲液濃度

C2：低滲液濃度 C3：濃縮液濃度

最佳載藥條件考察：

采用單因素設(shè)計(jì)方法，考察在不同載藥溫度（4℃，25℃，37℃），載藥濃度（0.2-1.0mg/mL），RBC和STS體積比（2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4）條件下紅細(xì)胞的載藥量。結(jié)果如圖圖1-A所示，預(yù)膨脹紅細(xì)胞與STS在37℃孵育，紅細(xì)胞的載藥量可達(dá)到68.86±1.62%，明顯高于4℃（44.46±2.60%）和25℃（62.56±0.49%）；載藥濃度考察表明在0.2-1.0mg/ml范圍內(nèi)，紅細(xì)胞的載藥量隨著STS濃度的增大而增大，因此選擇本實(shí)驗(yàn)STS載藥濃度為1.0 mg/ml，如圖1-B；考察STS和RBCs體積比是發(fā)現(xiàn)載藥量隨著紅細(xì)胞體積的減少而下降，當(dāng)STS與紅細(xì)胞體積比為2：1時(shí)，其對(duì)STS的載藥量達(dá)到最大，結(jié)果見(jiàn)圖1-C。

圖1 STS-RBC制備條件的優(yōu)化：溫度（4,25,37℃）對(duì)包封率的影響（A）；STS濃度（0.2-1.0mg/ml）對(duì)STS-RBC包封率的影響（B）；載藥體積比對(duì)STS-RBCs包封率的影響（C）。Figure 1. Optimization of drug loading conditions∶ effect of temperature on encapsulation efficiency of STS-RBCs (4, 25, 37℃) (A); effect of STS concentration on the entrapment efficiency of STS-RBCs (0.2-1.0mg/ml) (B); effect of drug loading volume ratio on entrapment efficiency of STS-RBCs (VSTS∶VRBCs=1∶3, 1∶2, 1∶1, 2∶1, 3∶1) (C).

2.4 STS-RBCs載藥前后形態(tài)觀察

正常紅細(xì)胞的形態(tài)像一個(gè)中間凹和邊緣厚的圓盤(pán)，如圖2-A所示。在用62%×PBS孵育RBCs后，紅細(xì)胞腫脹并變大，表面空隙打開(kāi)，如圖2-B所示。用10×PBS孵育RBCs后，RBCs恢復(fù)正常大小，表面孔閉合，如圖2-C所示。

圖2 正常紅細(xì)胞的形態(tài)（A），預(yù)膨脹后紅細(xì)胞的形態(tài)（B），載藥后STS-RBC的形態(tài)（C）Figure 2. The morphology of normal RBCs (A), per-expansion RBCs (B) and STS-RBCs (C)

圖3 在不同轉(zhuǎn)速下（1000-6000 rpm），STS-RBCs的離心穩(wěn)定性（A）；通過(guò)控制STS-RBC通過(guò)4.5號(hào)注射器針頭的次數(shù)，考察湍流穩(wěn)定性（B）；在5000Lux光強(qiáng)度下的光照穩(wěn)定性（C）Figure 3.The stability of STS-RBCs under different centrifugal forces (1000-6000rpm) (A); the turbulence stability of the STS-RBCs was evaluated by the number of injections of the 4.5 injector (B); the stability of STS and STS-RBCs at different time points under 5000Lux light intensity (C).

2.5 STS-RBCs穩(wěn)定性考察

2.5.1 離心穩(wěn)定性

取0.5ml STS-RBCs，加入PBS溶液2ml混勻后，分別于1000-6000rpm條件下離心10min，取上清，按2.1項(xiàng)下方法，測(cè)定上清液中STS的含量。結(jié)果表明，隨著離心轉(zhuǎn)速的增大，STS-RBCs穩(wěn)定性下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到3000rpm時(shí)，STS的滲漏量為0.121±0.005mg，明顯高于2000rpm時(shí)的0.044±0.006mg，結(jié)果見(jiàn)圖3-A。

2.5.2 湍流穩(wěn)定性

按2.3法制備STS-RBCs懸液，取1mLSTS-RBCs懸液，使其通過(guò)4.5號(hào)注射器針頭，通過(guò)控制其通過(guò)注射器針頭的次數(shù)（5，10，15，20，25次），然后分別在2000rpm條件下離心10min，取上清，按2.1項(xiàng)下方法，對(duì)STS進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，載藥紅細(xì)胞湍流穩(wěn)定性較好，在通過(guò)4.5號(hào)注射器針頭20次時(shí)，其STS滲漏量?jī)H0.123±0.007%，當(dāng)沖擊次數(shù)增加至25次時(shí)，STS滲漏量?jī)H為0.278±0.006%，表明隨著沖擊次數(shù)的增加，STS-RBCs的穩(wěn)定性雖然逐漸下降，但仍有較高的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3-B。

2.5.3 光照穩(wěn)定性將STS-RBCs和相應(yīng)濃度的STS分別置于恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時(shí)，光強(qiáng)5000Lux，溫度25℃。分別于0，6，12，24，36，60，96小時(shí)取樣，并按照2.1項(xiàng)下方法測(cè)定其中STS濃度。結(jié)果表明，在光照強(qiáng)度為5000Lux條件下，STS-RBCs組的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于STS組，具體表現(xiàn)在照射6小時(shí)后，STS組的藥物含量降低至85.92±0.28%，而STS-RBCs組僅降至99.25±0.81%; 96小時(shí)后，STS組減少至初始劑量的52.85±0.68%而STSRBCs組為65.59±0.61%。因此將RBCs用做STS的載體能夠降低其光降解，結(jié)果見(jiàn)圖3-C。

2.5.4 溶血實(shí)驗(yàn)

配制2%紅細(xì)胞懸浮液，配制2%紅細(xì)胞全溶血。取2mL載藥紅細(xì)胞與2mL2%紅細(xì)胞懸浮液混勻（溶液1），取2mL壓積紅細(xì)胞與2ml2%紅細(xì)胞懸浮液混勻（溶液2），取2mL壓積紅細(xì)胞與2mLPBS（溶液3）取4mL 2%紅細(xì)胞全溶血（溶液4），將溶液1，2，3分別于37℃振搖下孵育15min，離心，取上清，紫外分光光度法對(duì)其在540nm處吸光度進(jìn)行測(cè)定。溶血率（%）=（A溶液1-A溶液2-A溶液3）/A溶液4×100%，溶血率為0.22%，小于5%，體外溶血實(shí)驗(yàn)合格，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 體外釋放考察

取4ml載藥紅細(xì)胞和相同藥量的丹參酮IIA磺酸鈉于透析袋內(nèi)，釋放介質(zhì)為1000ml PBS，介質(zhì)溫度37℃，分別于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48h取樣，HPLC法測(cè)定STS釋放量。繪制藥物釋放曲線。結(jié)果如圖5所示，將RBCs作為STS的載體之后，其相對(duì)于游離藥來(lái)講明顯釋放緩慢。游離藥在6小時(shí)是釋放已經(jīng)接近100%，而STS-RBCs在6小時(shí)時(shí)僅釋放了6.76%±0.74%。STSRBCs在48小時(shí)之后還在持續(xù)緩慢釋放，具有明顯的緩慢釋放效果。

表1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1.Hemolysis test results

Figure 5 In-vitro release profile of STS-RBCs and STS in PBS solution at 37°C

3 討論

考察紅細(xì)胞載藥濃度時(shí)，對(duì)STS的濃度考察最大為1mg/ml，是由于STS在62%×PBS中溶解度有限。且在加入10×PBS濃縮液時(shí)，當(dāng)STS濃度高于1mg/ml時(shí)，會(huì)有STS結(jié)晶析出。

對(duì)STS-RBC載藥量考察時(shí)，選用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，對(duì)紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行HPLC分析，表明其不會(huì)對(duì)STS主峰產(chǎn)生干擾。

目前已有大量研究采用紅細(xì)胞膜載藥，通過(guò)擠出法控制載藥紅細(xì)胞膜粒徑為納米級(jí)別[3-5]，極大的提高了其穩(wěn)定性。且通過(guò)擠出法控制其粒徑為100-200nm，可有效逃避巨噬細(xì)胞攝取，使藥效得到更長(zhǎng)久的發(fā)揮。但是紅細(xì)胞膜載藥破壞了紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，其在生物相容性和生物降解性方面的特性需進(jìn)一步考察。且紅細(xì)胞膜載藥對(duì)載藥量有很大限制。目前有很多研究采用脂質(zhì)插入法對(duì)載藥紅細(xì)胞膜納米球進(jìn)行修飾，將其靶向至特定部位[16]。如何將紅細(xì)胞載藥和紅細(xì)胞膜載藥的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，研制出穩(wěn)定性好，載藥量高，保留紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，并具有有效靶向特性的載體，是我們繼續(xù)努力的目標(biāo)。

（作者單位：廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系）

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秦凌浩

董曉婷（1989～），女，2014級(jí)碩士研究生；通信作者：秦凌浩（1980～），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幬镄录夹g(shù)。

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030310362）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201508010036）；廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（特色藥用脂質(zhì)新產(chǎn)品的研究、開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化，201605131249066）