干細胞來源的外泌體:心肌梗死治療新啟示

宋菲　綜述　俞夢越　審校

(1.北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 阜外醫(yī)院，北京100044；2.中國醫(yī)學科學院 阜外醫(yī)院，北京100044)

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干細胞來源的外泌體:心肌梗死治療新啟示

宋菲1綜述俞夢越2審校

(1.北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 阜外醫(yī)院，北京100044；2.中國醫(yī)學科學院 阜外醫(yī)院，北京100044)

【摘要】外泌體是在細胞間交流中起重要作用的外分泌納米級磷脂雙層囊泡，可由多種細胞分泌，在細胞間有效轉運蛋白質(zhì)、RNA等生命活性物質(zhì)。值得注意的是，近期研究發(fā)現(xiàn)干細胞分泌的外泌體可以減少心肌細胞凋亡，促進心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞增殖分化，因而為心肌梗死提出了一種創(chuàng)新的生物分子治療方式，現(xiàn)主要論述干細胞來源外泌體在治療心肌梗死中的最新研究進展和對未來治療應用的展望。

【關鍵詞】外泌體；干細胞；心肌梗死

急性心肌梗死時冠狀動脈急性閉塞和再灌注治療時缺血-再灌注損傷均可引起心肌細胞急性缺血缺氧，觸發(fā)炎癥反應，心肌細胞壞死凋亡最終導致心肌重構和難以逆轉的心臟功能下降。因此多項研究寄希望于干細胞增殖分化為新的心肌細胞來彌補損失的心肌，改善心肌梗死后的心臟功能[1-2]。但最近研究表明干細胞在移植心臟中的成活率和分化率很低，干細胞移植獲益可能主要通過其外分泌作用[3]。而其中干細胞分泌的外泌體被認為可能是發(fā)揮主要作用的因子。近幾年隨著對干細胞來源外泌體研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體不僅可以在心肌梗死后促進微血管增生、抑制纖維化改善心臟功能，在再灌注治療中應用還可以減輕炎癥反應和氧化應激損傷，抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積。而且其易提取，易改造，與干細胞移植相比低風險的優(yōu)勢使其在心肌梗死治療中有著良好的應用前景。現(xiàn)主要總結干細胞來源外泌體的最新研究進展及其在心肌梗死治療中應用的展望。

1外泌體簡介

外泌體(exosome)是細胞分泌的脂質(zhì)雙層膜囊泡。與其他直徑為100～1 000 nm直接起源于細胞質(zhì)膜的胞外膜泡(extracellular vesicles，EVs)不同，外泌體起源于細胞的內(nèi)體系統(tǒng)。首先細胞膜內(nèi)陷形成初級內(nèi)體，內(nèi)體膜再次內(nèi)陷形成多個腔內(nèi)小泡(intraluminal vesicles，ILVs)，此時包含多個ILVs的內(nèi)體即次級內(nèi)體也叫做多泡體(muiltivesicular body，MVB)。MVB膜與細胞質(zhì)膜融合而釋放的直徑為30～100 nm的脂質(zhì)雙層膜囊泡即為外泌體(圖1)。研究表明，外泌體主要運載內(nèi)源性蛋白、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)，通過靶細胞內(nèi)化、受體-配體間相互作用或脂質(zhì)膜融合在細胞間傳遞信息[4-5]。近幾年在心血管方面的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在心肌細胞間信息的傳遞對心血管系統(tǒng)有著重要的影響(圖2)。

圖片引自Ailawadi S,Wang X,Gu H,et al.Pathologic function and therapeutic potential of exosomes in cardiovascular disease[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(1):1-11.

圖1微泡和外泌體的產(chǎn)生和分泌過程

MSCs：mesenchymal stem cell，間充質(zhì)干細胞；HSC： hematopoietic stem cell，造血干細胞；CPC：cardiac stem cell，心肌干細胞；CSC：cardiosphere cell，心肌球細胞；iPSC：induced pluripotent stem cell，誘導多能干細胞；ESC：embryonic stem，胚胎干細胞

圖2多種干細胞來源的外泌體的心臟保護作用

2干細胞來源的外泌體

2.1間充質(zhì)干細胞來源的外泌體

間充質(zhì)干細胞(MSCs)在干細胞治療心血管疾病中有著良好的應用前景，MSCs有多分化潛能，已經(jīng)被證實移植到心臟的MSCs可以分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞[6-7]，從而彌補心肌梗死后心肌細胞和血管的損失，改善心臟功能。同樣其治療中最大的困難為移植后的MSCs僅有少量存活并且分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌豐富的外分泌因子發(fā)揮心血管保護作用[8]，其中包括豐富的外泌體。外泌體對缺血性心臟病的保護作用及其作用機制引起了廣泛的研究興趣。

2.1.1抗細胞凋亡作用

Arslan等[9]研究均發(fā)現(xiàn)在活體小鼠心肌缺血-再灌注模型中，體外分離的外泌體注射到小鼠體內(nèi)可以明顯減少心肌梗死面積，并且Arslan等在外泌體治療后28 d再次觀察發(fā)現(xiàn)，心腔重構明顯減輕，心臟功能明顯增強，說明外泌體不僅可以在急性期減少心肌細胞凋亡，對心肌梗死后的長期預后也有明顯的改善。

有文獻認為MSCs來源的外泌體(MSC-exo)發(fā)揮抗細胞凋亡作用主要與外泌體中的miRNA(micro-RNA)-22和miRNA-221有關。MSCs分泌的外泌體中富含的miRNA-22，通過作用于目標細胞中的甲基化CpG結合蛋白發(fā)揮抗凋亡作用[10]，同時miRNA-221通過抑制p53正向凋亡調(diào)控因子發(fā)揮抗細胞凋亡作用[11]。另有研究認為外泌體可能補充在心肌缺氧和再灌注時丟失的氧化磷酸化途徑中的關鍵酶，從而恢復心肌能量儲備，減少氧化應激，減少心肌細胞凋亡。研究證實外泌體與靶細胞結合后可以迅速調(diào)控細胞內(nèi)與細胞凋亡密切相關的信號傳導通路。例如通過激活IGF-1a/PI3K/Akt途徑和抑制c-JNK的磷酸化阻止細胞凋亡[9]。最近有文獻報道趨化因子受體CXCR4超表達的MSC-exo與普通MSC-exo相比大大增加IGF-1a/PI3K/Akt途徑激活效率，減少細胞凋亡[12]。

2.1.2血管新生作用

不少研究通過體外內(nèi)皮細胞培養(yǎng)實驗已經(jīng)證實各種來源的MSCs有促進血管內(nèi)皮增生、遷移、新生血管的作用。例如，胚胎MSCs在缺氧狀態(tài)下分泌的外泌體可促進胚胎微血管內(nèi)皮細胞的遷移和血管化[13]。脂質(zhì)間充質(zhì)干細胞可促進人類微血管內(nèi)皮的增生和遷移，并且血小板生長因子可以促進脂質(zhì)MSCs釋放富含促進血管增生分子的外泌體[14]。人臍帶MSCs來源的外泌體在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(EA.hy926 cells)成管狀結構和內(nèi)皮細胞遷移中作用明顯[15]。Kang等[12]在進一步研究中將預先用MSC-exo處理過的細胞補片系統(tǒng)(cell patch system)植入小鼠體內(nèi)。4周后用免疫染色測定血管性血友病因子的含量明顯增多，進一步證實了MSC-exo新生血管的作用。同時，Bian等[16]也發(fā)現(xiàn)在心肌梗死小鼠模型中心肌注射MSCs來源的微泡 (主要包括微粒和外泌體)可顯著改善血流恢復。以上體外細胞培養(yǎng)和小鼠在體實驗均表明MSC-exo可促進血管內(nèi)皮細胞增生遷移，促進心肌梗死后的微血管增生。

2.1.3抗炎和抗纖維化作用

心肌梗死再灌注時，炎癥細胞的浸潤會造成心肌的進一步損害，有研究表明外周白細胞計數(shù)與心肌梗死面積、心臟功能和臨床預后明顯相關[9]。Arslan等[9]使小鼠心肌缺血30 min，于再灌注之前5 min注射外泌體或生理鹽水，發(fā)現(xiàn)再灌注后1～3 d注射外泌體一組中性粒細胞和巨噬細胞局部浸潤明顯比生理鹽水組要少，而且外周白細胞數(shù)量也明顯減少。因此認為心肌梗死再灌注之前應用外泌體可減輕心臟和全身的炎癥反應，保護心臟功能。

外泌體通過作用于成纖維細胞，可以減輕心肌缺血部位的纖維化。Zhao等[15]用Masson 三色染色法發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠模型經(jīng)外泌體治療后的心肌纖維化明顯減輕。

2.1.4缺血預適應

缺血預適應對缺血心肌的保護作用已經(jīng)得到廣泛證實[17]然而機制并未完全闡明。最近，F(xiàn)eng等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過缺血預處理的MSC-exo在小鼠心肌梗死活體模型中與普通MSC-exo相比可進一步減少心肌細胞凋亡和纖維化。經(jīng)過缺血預處理的MSC-exo中miRNA-22含量比普通MSC-exo高4.5倍或更高，提示這種作用可能主要由miRNA-22介導，然而是否與其他蛋白或分子有關尚不明了[10]。

2.2造血干細胞來源的外泌體

同MSCs一樣，移植后的造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)存活和分化率極低，但確實可以改善心臟功能，提示其是HSC的外分泌功能在發(fā)揮主要作用[18]。關于HSC來源的外泌體目前研究最清楚的為CD34+干細胞來源的外泌體在體外和體內(nèi)實驗均有顯著的新生血管的作用，可加強內(nèi)皮細胞活性，促進增生和形成管樣結構。然而，CD34-的HSC來源的外泌體(HSC-exo)卻無此功能[19]，經(jīng)過比較CD34+HSC-exo和CD34-HSC-exo內(nèi)的成分，發(fā)現(xiàn)CD34+HSC-exo內(nèi)miRNA-126和miRNA-130a含量明顯較高，因此推測miRNA-126和miRNA-130a為促進血管新生的關鍵分子，但具體機制尚未清楚[19]。

Mackie等[20]將對CD34+細胞進行基因修飾，添加有生血管作用的音猬因子(Shh因子)的基因，發(fā)現(xiàn)CD34+(Shh)分泌的外泌體富含Shh因子，且生血管作用在活體心肌梗死小鼠模型中明顯增強。該研究將有保護作用的基因植入干細胞中，通過外泌體與周圍細胞之間的物質(zhì)運輸和信息交流作用，使目的基因在目標細胞內(nèi)過表達，達到治療效果，對外泌體治療作用又有了新的啟示。

2.3心臟祖細胞來源的外泌體

早在2010年，Vrijsen 等[21]就發(fā)現(xiàn)心臟祖細胞來源的外泌體(CPC-exo)在體外抓痕試驗中可以促進內(nèi)皮細胞的遷移。Barile等[22]在體外細胞培養(yǎng)實驗中證實心肌干細胞(cardiac stem cell，CPC)可以促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的成管作用，并抑制心肌細胞凋亡。在體內(nèi)實驗中，研究者進一步向心肌梗死小鼠模型的梗死區(qū)域注射CPC-exo，證實CPC-exo可以減少心肌梗死面積，增加血管密度并改善心肌梗死后的心臟功能。

Chen等[23]發(fā)現(xiàn)CPC來源的外泌體可被H9C2細胞快速攝取，并且可以明顯抑制H2O2刺激后的caspase 3/7活性，抑制細胞凋亡。同時，在小鼠急性心肌缺血-再灌注活體模型中，CPC-exo與對照組相比可大幅度減少心肌細胞凋亡(53%)。此外，該研究發(fā)現(xiàn)外泌體囊泡中富含miRNA-144，提示后者可能是心臟保護作用的主要原因[23]。

正常條件下分泌的CPC-exo對心肌的保護作用已有大量證據(jù)，缺血預適應處理過的CPC-exo的心臟保護作用近來也得到證實。Gray等[24]發(fā)現(xiàn)，缺血預適應處理過的CPC-exo與普通條件下相比，新生血管作用和抗纖維化作用更加明顯。通過基因芯片和計算機建模分析比較顯示，缺氧預處理的外泌體與常規(guī)條件下分泌的外泌體比較miRNA成分有明顯變化，調(diào)節(jié)血管生成和抑制纖維化的miRNA明顯增多。

心臟祖細胞可以分化為心球樣細胞團[25]，其中包含原始細胞和定向分化的三種祖細胞(心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞)。有研究表明，心球樣細胞團來源的外泌體同樣可以促進CPC增生、血管新生和改善心臟功能[26]。

2.4胚胎干細胞和誘導多能干細胞來源的外泌體

關于胚胎干細胞和誘導多能干細胞來源的外泌體的研究很少。分化程度較低的干細胞雖然分化增生功能較強，但同時分化定向性差和倫理等問題使其應用受到局限，但其分泌的外泌體則可能保留較強的促心肌細胞增殖分化的能力同時可以避免干細胞移植體內(nèi)帶來的問題。最近，有研究證實胚胎干細胞來源的外泌體有良好的血管生成、抑制纖維化作用，最重要的是在心肌梗死后可以復蘇心臟的增生反應，促進心肌干細胞增殖分化[27]。同時Wang等[28]也證實誘導多能干細胞來源的外泌體可以在心肌缺血-再灌注模型中起到保護心肌的作用，并且避免移植細胞帶來的致瘤風險。

3干細胞來源的外泌體與miRNA

外泌體是細胞之間運輸?shù)鞍酌负蚼iRNA的良好載體，因為這些活性成分一旦暴露于體液環(huán)境中，會很快降解失活。近年來，對外泌體研究熱度增加的同時也引起了人們對其中包含的miRNA成分的關注，而且越來越多的證據(jù)表明miRNA可能在外泌體發(fā)揮心臟保護作用中起關鍵作用。如前文所述，MSCs分泌的外泌體中富含的miRNA-22和miRNA-221，通過作用于目標細胞中的甲基化CpG結合蛋白和抑制p53正向凋亡調(diào)控因子發(fā)揮抗細胞凋亡作用[10-11]，而且經(jīng)過缺血預處理的MSC-exo中miRNA-22含量是普通MSC-exo的4.5倍或更高，與普通MSCs-exo相比可進一步減少心肌細胞凋亡和纖維化[10]；CD34+干細胞來源的外泌體在體外和體內(nèi)實驗中均有明顯的血管生成作用，其中富含的miRNA-126和miRNA-130a可能為發(fā)揮作用的主要分子[19]；CPC和其分化的心肌球細胞來源的外泌體中富含的miRNA-144、miRNA-451和miRNA-146a對血管生成和心肌細胞再生也有重要作用(如表1)[22-23]。

表1　不同干細胞來源的外泌體中富集的mi-RNA及其保護作用

4對治療的啟示及展望

越來越多的研究表明外泌體可在心肌梗死急性期減少細胞凋亡、減輕炎癥反應、減少心肌梗死面積，后期促進血管生成，抑制纖維化，減輕心肌重構從而改善心肌梗死后的心臟功能。外泌體的這些特性使得其在治療心肌梗死中存在良好的應用前景。體外分離干細胞來源的外泌體再注射到體內(nèi)的治療方式，在臨床前期的鼠類在體試驗中，得到良好的結果且并不遜于體內(nèi)干細胞移植的治療方式，相比可以降低移植手術和干細胞分化為其他組織甚至致瘤的風險。

此外，通過對干細胞進行不同的處理可以得到更高效的外泌體，例如缺血預適應處理或超表達某種想要的基因產(chǎn)物。得到富含心肌保護作用的蛋白和miRNA 的外泌體，可能成為以后新的研究熱點。

目前，雖然有越來越多的研究證實干細胞來源的外泌體對心肌梗死后心肌的保護作用，但具體分子機制并不十分清楚。通過對外泌體中包含的主要有效成分及其作用機制的研究可以幫助找到新的治療方法。例如最新的研究探討聯(lián)合應用有效成分miRNA和干細胞聯(lián)合治療心肌梗死[29]。

干細胞來源的外泌體治療心肌梗死可能成為十分有前景的新的治療方法，但目前研究仍處于臨床前期，而且作用機制研究不足。增加外泌體治療心肌梗死的效率和安全性可能是以后亟需解決的問題。

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Exosomes Derived from Stem Cells: Novel Approach in Treatment of Myocardial Infarction

SONG Fei1, YU Mengyue2

(1.PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences&FuWaiHospital,Beijing100044,China;2.ChineseAcademyofMedicalSciences&FuWaiHospital,Beijing100044,China)

【Abstract】Exosomes are nanosized secreted vesicles with phospholipid bilayers, which play important roles in cell-to-cell communication.Exosomes can be released by various cells and transport protein and RNA effectively between cells.Recent studies discovered that exosomes derived from stem cells exerted anti-apoptosis,cardiac regeneration and neo-vascularization effect, which are considered as novel molecular mechanisms of therapeutic potential of myocardial infarction.This review mainly summarizes the recent advances in research and discussed exosomes as a novel approach in the treatment of myocardial infarction in the future.

【Key words】Exsomes; Stem cell; Myocardial infarction

收稿日期：2015-11-19修回日期：2015-12-23

【中圖分類號】R542.2

【文獻標志碼】A【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.02.000

作者簡介：宋菲(1990—)，在讀碩士，主要從事冠心病研究。Email: songfeifeisong@163.com通信作者：俞夢越(1973—)，主任醫(yī)師，碩士生導師，博士，主要從事冠心病介入研究。Email: yumy73@163.com