免疫磁珠陽性篩選聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)對胰腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的診斷價值

張菊英,張亞衡

(羅田縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡438600)

?

免疫磁珠陽性篩選聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)對胰腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的診斷價值

張菊英,張亞衡*

(羅田縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡438600)

摘要：目的通過免疫磁珠陽性篩選聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，探討其敏感性及診斷價值。方法將我院自2013年06月至2014年12月期間收治67例胰腺癌患者作為觀察組，同時選取健康體檢者19例作為對照組。采用ACD采血管收集抗凝血7.5 mL，人淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解處理后加入EPCAM(CD326)抗體標(biāo)記磁珠，通過MAC分離柱收集CD326抗體陽性細(xì)胞，最后加入CD45、Cytokeratin、CD326抗體標(biāo)記上流式儀檢測以獲得CTCs個數(shù)。將CTCs個數(shù)與患者年齡、腫瘤大小、位置、分期、是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及腫瘤標(biāo)志物CA19-9進(jìn)行相關(guān)性分析。同時通過對健康體檢者血液分別加入5、50、100、500個胰腺癌腫瘤細(xì)胞以檢測該方法的敏感性。結(jié)果觀察組中CTCs陽性率達(dá)80.6%。CTCs數(shù)量與腫瘤分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、血清腫瘤標(biāo)志物CA19-9顯著相關(guān)(P<0.01)，與性別、腫瘤位置及大小無關(guān)。健康體檢者檢出CTCs數(shù)量均為0個。CTCs的回收率分別為66.7%、86.7%、87.3%及83.3%。結(jié)論免疫磁珠陽性篩選聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)可有效診斷胰腺癌CTCs，并對評估腫瘤風(fēng)險(xiǎn)有一定的臨床價值。

關(guān)鍵詞：胰腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；CA19-9

(ChinJLabDiagn,2016,20:0551)

胰腺癌發(fā)病隱匿，大部分胰腺癌患者在確診時已出現(xiàn)多臟器或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會，5年生存率<5%[1]。CA19-9為臨床常用胰腺癌腫瘤標(biāo)志物，但特異性不高。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)檢測亦稱為血液活檢，其檢測方法主要包括免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法及Cell Search法等。本實(shí)驗(yàn)采用上皮細(xì)胞特異的單抗磁珠富集法對CTCs進(jìn)行初篩，創(chuàng)新性地聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)對CTCs進(jìn)行定量檢測，并將計(jì)數(shù)結(jié)果與臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以此對該法進(jìn)行應(yīng)用價值評估。

1材料與方法

1.1一般資料

觀察對象為2013年06月至2014年12月期間在我院住院的67例胰腺癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例經(jīng)病理組織學(xué)確診均為胰腺導(dǎo)管上皮腺癌；②患者入組前均未經(jīng)治療處理；③簽署知情同意書；④無其它惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其它惡性腫瘤。同時選取19例體格檢查正常，無腫瘤病史健康體檢者作為對照組，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會審批并通過。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

FACSCanto II流式細(xì)胞儀、紅細(xì)胞裂解液、枸櫞酸抗凝血采血管(ACD管)購于美國BD公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。MACS buffer、EPCAM(CD326)磁珠、CD45-PE抗體、CK3-6H5-FITC抗體、CD326(EpCAM)-APC抗體、LS磁珠分離柱、QuadroMACSTM分離器均購于德國美天妮公司。5430R臺式冷凍離心機(jī)購至德國艾本德公司。

1.3CTCs免疫磁性標(biāo)記、富集和分選

患者在化療或手術(shù)前1天清晨空腹采血。為防止皮膚上皮細(xì)胞污染，先抽取5 ml肘靜脈抗凝血用作其它檢查，再用ACD采血管采集抗凝血7.5 ml檢測CTCs。將血液用移液管轉(zhuǎn)入50 ml離心管中，4℃1 200轉(zhuǎn)/min離心20 min，在血細(xì)胞中加入HBSS至15 ml，重懸血細(xì)胞后，緩慢加至含有15 ml淋巴細(xì)胞分離液的50 ml離心管的液(室溫)面上，配平后1 200轉(zhuǎn)/min室溫離心20 min，吸出霧狀單個核細(xì)胞層；加入10 ml HBSS 1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min去上清，洗兩遍，加入5 ml紅細(xì)胞裂解液工作液(1∶10=濃縮液∶滅菌純水)重懸細(xì)胞，避光室溫放置10 min，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min去上清；加入10 ml HBSS重懸細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清后，加入1 ml HBSS，吹勻后計(jì)數(shù)，懸液1 200轉(zhuǎn)/min離心10 min，去上清，加入MACS buffer 5 ml重懸細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清；用余液重懸細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)>2×107，需加入MACS buffer)，加入CD326磁珠(20 μl /107個細(xì)胞)4℃遮光孵育30 min，用MACS Buffer(107個/L)2 ml洗滌細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min，離心5分鐘，去上清；取LS磁珠分離柱安裝于磁板上，用3 ml MACS buffer潤洗分離柱，用500 μl MACS buffer(≤50×106)重懸細(xì)胞后加入分離柱，等液體全部流出；用3 ml MACS buffer涮洗管壁后加入分離柱(1次)，3 ml MACS buffer 加入分離柱(2次)；加入5 ml MACS buffer然后迅速取出分離柱放于流式管上，取推壓器將分離管的液體推入流式管中，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清；加入1 ml HBSS后重懸細(xì)胞，吹勻后計(jì)數(shù)，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清；加入抗體CK、CD326、CD45 10 μl(10 μl/106)，充分混勻，重懸細(xì)胞，室溫避光孵育12 min，再加入4 ml PBS離心清洗1次，去上清后加入500 μl PBS上流式細(xì)胞儀檢測(或2%甲醛保存過夜第2天檢測)。流式細(xì)胞儀檢測步驟：先在SSC、FSC圖上設(shè)P1。選擇CD45陰性細(xì)胞為P2，在P2細(xì)胞群中選擇CD326和 CK3-6H5陽性細(xì)胞群為檢測的CTCs細(xì)胞，檢驗(yàn)標(biāo)本的CTCs數(shù)為每例檢測標(biāo)本細(xì)胞數(shù)減去陰性對照標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)。

1.4敏感性實(shí)驗(yàn)

將5、50、100、500個人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3細(xì)胞分別摻入到7.5 ml健康體檢者抗凝血液中，免疫磁珠陽性分選、標(biāo)記相關(guān)抗體及流式細(xì)胞儀檢測CTCs方法與1.3同，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.5腫瘤標(biāo)志物檢測

取患者治療前空腹清晨靜脈血5 ml，3 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，分離血清后上機(jī)檢測(IA2000 全自動免疫分析儀，日本東曹株式會社)。具體操作按CA19-9定量測定試劑盒(日本東曹株式會社)說明書嚴(yán)格執(zhí)行。診斷標(biāo)準(zhǔn)以CA19-9>39 U/ml水平為陽性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1CTCs與患者癌癥因素、腫瘤標(biāo)志物水平相關(guān)性分析

觀察組年齡32-67歲，平均(41.0±8.9)歲。腫瘤平均最大徑為3.7±0.7cm(1.3-6.8cm)。對照組包括男10例，女9例，年齡26-59歲，平均(38.2±7.2)歲。觀察組及對照組年齡、性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。觀察組外周血CTCs檢出率為80.6%(54/67)，檢測到CTCs個數(shù)為0-125個，平均1.84個/ml血液。對照組未檢測出CTCs，檢出率為0.0%(0/19)。CTCs數(shù)量與腫瘤分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)，與性別、腫瘤位置、年齡及腫瘤大小無關(guān)(表1)。

表1　CTCs與胰腺癌臨床參數(shù)的相關(guān)性(n=67)

注：a表示Ⅰ期分別與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CTCs數(shù)目相比；b為Ⅱ期與Ⅲ期相比；c為Ⅲ期與Ⅳ期相比；d為Ⅱ期與Ⅳ期相比；

2.2敏感性實(shí)驗(yàn)

向7.5 ml血液中分別摻入5、50、100、500個腫瘤細(xì)胞的陽性檢出率為66.7%、86.7%、87.3%及83.3%。

2.3CTCs與CA19-9的相關(guān)性分析

所有入組患者均進(jìn)行治療前血清CA19-9檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：觀察組CA19-9水平陽性率為88.0%(59/67)，平均為(570.3 ±412.8)U/ml。健康對照組CA19-9水平(18.49±6.31)U/ml，陽性率0.0%。觀察組中，CTC檢驗(yàn)陽性者CA19-9水平與檢驗(yàn)陰性者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2CTCs與腫瘤標(biāo)志物CA19-9的相關(guān)性

CTC結(jié)果nCA19-9(U/ml)P≥149695.9±302.90.0057<118165.8±123.9

注：(CTCs個數(shù)/7.5 ml)≥1個判讀為陽性結(jié)果；<1個為陰性結(jié)果。

3討論

CTCs在外周血的含量稀少，對其進(jìn)行檢測前多先進(jìn)行CTCs的富集?，F(xiàn)常用方法包括密度梯度離心法、濾過富集法以及免疫磁珠分離法[2]。有研究表明，免疫磁珠分離法特異性及敏感度均高于其它富集技術(shù)。細(xì)胞回收率可達(dá)85%，適宜廣泛應(yīng)用。 對富集后的胰腺癌CTCs進(jìn)行檢測的方法主要有以下兩種：ICC法及RT-PCR法。①ICC法：主要利用CK、CD45熒光抗體及熒光染料DAPI對細(xì)胞分別染色后通過熒光顯微鏡鑒別計(jì)數(shù)，結(jié)果直觀可靠。②RT-PCR法：通常檢測多個腫瘤標(biāo)志物如KRT19、MUC1、EPCAM、CEACAM5、BIRC5等基因來檢測CTCs[3]，但核酸來源不能明確且可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[1]，單純RT-PCR法檢測不能對CTCs進(jìn)行定量[10]。③Cellsearch系統(tǒng)：該設(shè)備于2010年被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的臨床檢測，其技術(shù)原理為免疫磁珠富集法聯(lián)合ICC法檢測CTCs[4]。現(xiàn)該設(shè)備已被用于胰腺癌患者外周血CTCs檢測并取得一定研究成果[5]。但該設(shè)備昂貴且檢測項(xiàng)目單一，耗材成本高，國內(nèi)普及率較低。因此，本研究創(chuàng)新性地利用免疫磁珠富集聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)對CTCs進(jìn)行定量，以求該法對胰腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的診斷價值。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：19例健康志愿者外周血中均未檢出CTCs。5、50、100、500個腫瘤細(xì)胞加入體檢者血液的CTCs的回收率分別為66.7%、86.7%、87.3%及83.3%，表明該方法鑒定胰腺癌特異度好、敏感性較高。與此同時，通過對入組患者檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：I期患者檢出率為20%(1/5)、Ⅱ期為58.3%(7/12)、Ⅲ期為85.7%(24/28)、Ⅳ期為100%(22/22)，即CTCs數(shù)量隨腫瘤分期改變在血液中含量升高，提示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)程加快，預(yù)后不良，可能與胰腺癌惡性程度高，易于通過血液轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與性別、腫瘤位置、大小等臨床參數(shù)無關(guān)。另外，入組患者CA19-9的陽性率達(dá)88.0%并與CTCs呈正相關(guān)，但由于CA19-9在慢性胰腺炎等其它疾病也可能升高，因此，在胰腺癌早期階段，聯(lián)合CTCs進(jìn)行診斷可有助于提高檢出率，從而對患者及早進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)減少轉(zhuǎn)移發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐小永,姜維民,于楠,等.胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2015,22 (7):889.

[2]郭新忠,宋麗華,馮斌,等.小細(xì)胞肺癌外周血腫瘤細(xì)胞定量研究方法的比較[J].中華腫瘤雜志,2013,35 (5):347.

[3]de Albuquerque A,Kubisch I,Breier G,et al.Multimarker gene analysis of circulating tumor cells in pancreatic cancer patients:a feasibility study[J].Oncology,2012,82 (1):3.

[4]王麗娟,張妍,呂昭寶.乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞與分子生物學(xué)特征的相關(guān)性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015,19 (11):1946.

[5]Bobek V,Gurlich R,Eliasova P,et al.Circulating tumor cells in pancreatic cancer patients:enrichment and cultivation[J].World J Gastroenterol,2014,20 (45):17163.

The Diagnosis Value about the Peripheral Blood Circulating Tumor Cells of Pancreatic cancer by Positive-Screened Immune Magnetic Bead Combine with Flow Cytometry

ZHANGJu-ying，ZHANGYa-heng.

(LuodingPeople’sHospital,HubeiProvince,Huanggang438600,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the sensitivity and diagnostic value about the detect method of peripheral blood circulating tumor cells (CTCs) by immune magnetic beads combined with flow cytometry in pancreatic cancer patients.MethodsFrom June 2013 to December 2014,67 patients with pancreatic cancer were selected as observation group,and 19 healthy patients were selected as control group.After 7.5 mL EDTA anticoagulant blood was drawn and stored with ACD tube,the mononucleocytes were separated from the blood over Ficoll-Paque.the RBCs were removed using a lysis buffer.Labeled cells with CD326 antibodies microbeads,then collected CD326 antibody positive cells through MACS separator.Labeled cells with CD45,Cytokeratin,CD326 antibody and detected the number of CTCs with flow cytometry.We used CTCs number,patient age,tumor size,location,stage,whether the distal metastasis,tumor marker CA19-9 for correlation analysis.At the same time,5,50,100,500 pancreatic cancer cell line cells was added respectively into the control group blood to detect the sensitivity.ResultsIn the observation group,CTCs positive rate was 80.6%.The analyses showed that there was statistically significant difference (P<0.01) in the Number of CTCs between the distal metastasis,tumor stage and serum tumor marker CA19-9,but hasn’t difference between with the sex,tumor location,and tumor size (P>0.05).Control group were detected in CTCs quantity to zero.The recovery rate of CTCs are 66.7%,86.7%,87.3% and 83.3% respectively.ConclusionPositive-screened immune magnetic bead combine with flow cytometry can detect CTCs effectively and has certain clinical value to evaluate the risk of tumor.

Key words:pancreatic cancer;Circulating tumor cells;CA19-9

(收稿日期：2015-05-09)

中圖分類號：R735.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)04-0551-04