重組抗菌蛋白Reg3γ的表達、純化及鑒定

劉　彤，馮　野，高永建，丁大勇

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科,吉林 長春130033)

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重組抗菌蛋白Reg3γ的表達、純化及鑒定

劉彤，馮野，高永建，丁大勇*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科,吉林 長春130033)

哺乳動物腸道內(nèi)存在大量共生菌，這些共生菌對宿主的營養(yǎng)代謝有重要意義。宿主需要對腸腔內(nèi)的細菌進行一定的動態(tài)防御，腸道內(nèi)抗菌蛋白是腸道防御機制中重要的一項。再生蛋白3是一組由小腸paneth細胞分泌到腸腔的抗菌凝集素，大小約為16KD，包括小鼠Reg3γ和人HIP/PAP。目前，對于該類蛋白的表達和調(diào)控，各種功能的具體機制還不清楚。本文利用生物工程技術(shù)表達、純化重組Reg3γ蛋白質(zhì)，并對純化的重組蛋白進行了鑒定，為進一步分析再生蛋白3的功能及作用機制提供了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

鼠小腸cDNA庫由本實驗室構(gòu)建保存，來源于C57BL小鼠小腸組織。載體質(zhì)粒pET-30b(+)購自Novagen公司；感受態(tài)細胞DH5α、各種限制性內(nèi)切酶、連接酶及DNA聚合酶購自TaKaRa公司；真核表達大腸桿菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL購自Agilent Technologies公司；透析袋(MWCO 6,000-8,000)購自Spectrum Laboratories公司；SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換柱及SephacrylTMS-200 HR凝膠過濾柱購自GE Healthcare；兔抗鼠Reg3γ抗體購自Life Science INC；辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗購自Amersham Pharmacia。

1.2實驗方法

1.2.1表達載體構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的鼠Reg3γ基因mRNA序列(基因號NM_011260.1)，利用Primer Express version.1.5設(shè)計引物。Reg3γ上游引物：5′-ATTGCGAGGCATATGGAAGTTGCCAA GAAAGATGCCCCAT -3′；Reg3γ下游引物：5′- CTATGGGGATCCCTAGGCCTTGAATTTGCAG ACATAGGGT -3′ 。上游引物包含NdeI酶切位點(用下劃線表示)，下游引物包含BamHI酶切(用下劃線表示)。PCR反應(yīng)條件為：94℃2分后94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒行30個循環(huán)，最后72℃5分。

將pET-30b(+)質(zhì)粒和Reg3γPCR產(chǎn)物進行雙酶切。使用DNA連接酶將預(yù)處理的目的片段和載體連接成為重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ，重組質(zhì)粒擴增抽提后，行質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序。熱沖擊法將經(jīng)過鑒定的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程大腸桿菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，應(yīng)用含卡那霉素和氯霉素的雙抗LB培養(yǎng)基篩選，完成表達載體的構(gòu)建。

1.2.2重組蛋白的小量制備及實驗條件確定從轉(zhuǎn)化的表達細菌平板上挑菌到1 ml LB液體培養(yǎng)基(含有卡那霉素30 μg/ml和氯霉素50 μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)過夜的菌液50 μl加入新的3 ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)2-4小時，使細菌OD達到0.6。菌液中加入0.5 mM IPTG后繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)2-6小時。收集菌液4℃6 500 g離心15分鐘，收集沉淀的細菌。細菌沉淀以清洗緩沖液重懸，以超聲破碎器將細菌破碎，4℃10 000 g離心10分鐘，沉淀和上清行SDS-PAGE檢測，確定重組蛋白的可溶性。調(diào)整培養(yǎng)誘導(dǎo)時間和IPTG濃度，確定最佳的表達條件。

1.2.3重組蛋白質(zhì)的大量表達根據(jù)小量制備的條件進行重組蛋白質(zhì)的大量表達。從轉(zhuǎn)化的表達細菌平板上挑菌到20 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液加入500 ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)4小時，使細菌OD達到0.6。菌液中加入0.5mM IPTG后繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)6小時。菌液加入10枚50 ml離心管，4℃6 500 g離心15分鐘，棄去上清液。各離心管細菌沉淀以2.5 ml 清洗緩沖液重懸。收集菌液至5枚50 ml離心管中，每枚5毫升。1分鐘，分2次以超聲細胞破碎器將細菌破碎。將細菌破碎液收集到4枚15 ml離心管中，4℃10 000 g離心10分鐘，棄上清，沉淀部分以清洗緩沖液重懸，以勻漿器勻漿2次。4℃10 000 g離心10分鐘，棄上清，沉淀以重懸緩沖液(2.5 ml×4)重懸，室溫下振蕩2小時。將重懸液緩慢滴入復(fù)性緩沖液中，4℃緩慢攪拌24小時。

1.2.4重組蛋白的純化以上表達蛋白及復(fù)性液在室溫下10 000 g離心30分鐘，留取上清液，加入透析袋中。將透析袋放入5L透析緩沖液中， 4℃透析24小時，過濾復(fù)性液體中小分子雜質(zhì)。使用SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱和SephacrylTMS-200 HR凝膠過濾柱來純化重組蛋白。

1.2.5SDS-PAGE及Western Blotting檢測取重組蛋白樣品20 μl上樣，用5%濃縮膠和15%分離膠行SDS-PAGE電泳，電泳條件為定電流5 mA 20分鐘,20 mA 90分鐘。電泳后的凝膠根據(jù)需要行考馬斯亮藍染色或Western Blotting檢測。Western Blotting檢測中Reg3γ抗體濃度1∶2 000，二抗?jié)舛葹?∶1 000。

2結(jié)果

2.1表達載體構(gòu)建

通過PCR進行擴增的目的基因行瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出的條帶大小與理論值(474 bp)推測基本相符(圖1)。

pET-30b(+)質(zhì)粒及PCR后回收的基因片段經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切后連接通過DNA連接酶連接成為重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ。為了進一步確定重組質(zhì)粒的正確插入，我們進行重組質(zhì)粒抽提純，行雙酶切鑒定。酶切后DNA電泳圖譜可見兩段片段，與理論大小一致(圖2)。

2.2重組蛋白的小量制備及實驗條件確定

為確定表達細菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL的轉(zhuǎn)化成功及重組蛋白在大腸桿菌中的表達位置，我們進行重組蛋白Reg3γ的小量制備。在表達過程中，選取未加IPTG誘導(dǎo)菌液、IPTG誘導(dǎo)菌液、菌液離心的上清液、細菌裂解后的離心和上清液5個樣本行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色。如圖3所示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，有明顯16KD大小的蛋白質(zhì)表達，與理論Reg3蛋白大小相符。

細菌經(jīng)超聲裂解后，其上清液無重組蛋白的表達，在沉淀中有目標蛋白的表達。該結(jié)果說明重組Reg3蛋白質(zhì)是不溶的包涵體狀態(tài)，為取得有功能的重組蛋白需要進一步行包涵體的溶解復(fù)性和純化。通過調(diào)整培養(yǎng)誘導(dǎo)時間和IPTG濃度，確定最佳的表達條件為IPTG誘導(dǎo)濃度使用0.5 mM/L，IPTG的誘導(dǎo)時間為6小時(圖4)。

2.3重組蛋白質(zhì)的大量表達及純化

根據(jù)小量制備的條件，進行重組蛋白在大腸桿菌的大量制備。大量制備所得的包涵體經(jīng)過復(fù)性液復(fù)性后經(jīng)透析濾出中小分子雜質(zhì)。經(jīng)陽離子交換層析柱純化后仍有少許大分子雜質(zhì)，所以行進一步凝膠過濾純化(圖5)。

圖1小鼠Reg3γ基因PCR產(chǎn)物圖2重組質(zhì)粒 pET-30b(+)-圖3重組蛋白Reg3γ的小量制備。1、未加IPTG

瓊脂糖凝膠電泳，MW為Reg3γ基因酶切鑒定結(jié)誘導(dǎo)菌液 2、IPTG誘導(dǎo)后菌液 3、菌液離心

DNA分子marker。果，MW為DNA分子的上清液4、細菌經(jīng)超聲碎裂后的離心沉淀

marker。5、細菌碎裂后離心上清細菌裂解液上清。

M為蛋白質(zhì)marker。

圖4重組蛋白Reg3γ的小量制備條件。(a)IPTG圖5重組蛋白Reg3γ的表達和純化。1、未加IPTG誘導(dǎo)菌液

濃度對重組蛋白表達的影響。1、未誘導(dǎo)菌液；2、IPTG誘導(dǎo)后菌液 3、超聲碎裂后離心上清4、包涵體經(jīng)

2、IPTG 0.2 mM/L；3、IPTG 0.5 mM/L；4 IPTG 研磨清洗后離心上清5、復(fù)性蛋白質(zhì)經(jīng)離子交換層析柱純

0.8 mM；(b)誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達的影響。化后。M為蛋白質(zhì)marker。

1、未誘導(dǎo)菌液；2、誘導(dǎo)2小時；3、誘導(dǎo)4小時；

4、誘導(dǎo)6小時。

凝膠過濾層析是根據(jù)分子大小和形狀的差異進行分離的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。不同分子按照大小順序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。洗出的蛋白質(zhì)按濾出的順序分別存放在30個離心管中，如圖6所示除去重組蛋白中的大分子雜質(zhì)。

2.4重組蛋白的鑒定

經(jīng)純化的可溶性重組蛋白行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再行免疫印記(Western-blotting)檢測。如圖7所示，在大小約為16 KD位置上出現(xiàn)了清晰的特異性條帶，表明重組蛋白Reg3γ能夠與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，從免疫學(xué)上證明了Reg3γ重組蛋白表達的正確性。

3討論

越來越多的研究表明再生蛋白3在調(diào)節(jié)哺乳動物腸道內(nèi)細菌和宿主之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的意義[1]。除了抗菌作用[2]外，再生蛋白3還參與多種類型細胞的增殖和分化，具有抗凋亡和促有絲分裂等作用，與糖尿病[3]、腫瘤[4]及炎性腸道病[5]等多種疾病相關(guān)。為通過小鼠動物模型及體外深入研究再生蛋白3的功能及作用機制，本文利用生物工程技術(shù)在表達重組小鼠的Reg3γ蛋白質(zhì)。我們根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因序列設(shè)計引物，PCR擴增目的基因，將鼠Reg3γ基因插入pET-30b(+)質(zhì)粒成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ。

圖6重組蛋白Reg3γ經(jīng)凝膠過濾柱Sepharyl S-200R的純化。圖7重組蛋白Reg3γ的Western-blotting檢測。

M為蛋白質(zhì)marker。1、2為重組蛋白Reg3γ，3為陰性對照

許多情況下，在表達細菌中目的蛋白聚集成不溶的沒有生物活性的結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。形成包涵體有利于通過離心收獲相對純凈的蛋白。目標蛋白以無活性的包涵體形式表達，不會影響宿主菌的生長。Reg3γ蛋白具有抗菌作用，如果直接表達可溶的活性蛋白可能會對宿主細菌產(chǎn)生影響。pET-30b(+)質(zhì)粒是適合表達包涵體的質(zhì)粒，非常適合制備再生蛋白3這樣的小蛋白。

本研究通過小量制備確定了重組Reg3γ蛋白在大腸桿菌中表達的適合條件：IPTG誘導(dǎo)濃度使用0.5 mM/L，誘導(dǎo)時間為6小時。小量制備結(jié)果顯示重組Reg3γ蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達形式是不溶的包涵體狀態(tài)，與實驗設(shè)計相符。變性溶解的包涵體通過透析析出小分子雜質(zhì)，經(jīng)離子交換層析初步純化。離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點來進行分離純化蛋白質(zhì)的方法。本實驗中小鼠Reg3γ等電點為8.5，所以我們選擇使用陽離子交換柱。經(jīng)陽離子交換層析柱純化后仍有少許大分子雜質(zhì)，考慮為這兩種重組蛋白等電點接近中性，所以分離效果欠佳。凝膠過濾層析是根據(jù)分子大小和形狀的差異進行分離的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。不同分子按照大小順序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。本文重組蛋白Reg3γ經(jīng)凝膠過濾后，除去重組蛋白中的大分子雜質(zhì)，得到了純化的重組蛋白。純化的蛋白質(zhì)經(jīng)過Western-blotting檢測進一步的到鑒定。我們進一步還需要對重組蛋白的抗菌等功能進行體外鑒定。

綜上，我們的工作為進一步分析再生蛋白3的功能及作用機制提供了基礎(chǔ)。

參考文獻：

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[5]Granlund Av,Beisvag V,Torp SH,et al.Activation of REG family proteins in colitis[J].Scand J Gastroenterol,2011,46(11):1316.

(收稿日期：2015-11-14)

*通訊作者

基金項目：吉林省財政廳資助課題

文章編號：1007-4287(2016)04-0536-04