線粒體動態(tài)學(xué)改變在DEHP致大鼠子代神經(jīng)損傷中的作用

初　陽,黃曉莉,崔　壯*

(1.天津醫(yī)科大學(xué),天津300070;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

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線粒體動態(tài)學(xué)改變在DEHP致大鼠子代神經(jīng)損傷中的作用

初陽1,黃曉莉2,崔壯1*

(1.天津醫(yī)科大學(xué),天津300070;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

摘要：目的探討線粒體動態(tài)學(xué)改變是否在鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)損傷子代大鼠神經(jīng)細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。方法用不同濃度的DEHP對妊娠期母鼠進(jìn)行灌胃，待子鼠出生6周后，利用水迷宮定位航行和空間探索實驗檢測動物的神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，利用酶聯(lián)免疫吸附法(PCR)法和免疫蛋白(Western blot)法檢測子鼠海馬細(xì)胞線粒體融合基因Mfn1和分裂基因Drp1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果DEHP宮內(nèi)暴露的子代大鼠尋找平臺潛伏期明顯延長(P<0.05)、游泳路線長度增加(P<0.05)，平臺所在象限游泳的時間/(長度)與總時間(長度)的比明顯下降(P<0.05)，融合基因Mfn1的mRNA和蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而分裂基因Drp1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上升。結(jié)論宮內(nèi)暴露DEHP可致子代大鼠神經(jīng)損傷，使神經(jīng)行為發(fā)生改變，而線粒體動態(tài)失衡可能是DEHP改變大鼠神經(jīng)行為的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：DEHP;神經(jīng);線粒體動態(tài)學(xué);大鼠;水迷宮

(ChinJLabDiagn,2016,20:0525)

鄰苯二甲酸二乙基己酯 (di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)屬于鄰苯二甲酯類化合物，是目前塑料工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的增塑劑之一，可添加到塑料中以增強(qiáng)耐用性和使用壽命等。而隨著廣泛使用，大量鄰苯二甲酯類化合物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，因此在自然環(huán)境中分布的范圍非常廣，但其最終會通過食物鏈富集進(jìn)入人體，而DEHP是人體中含量最高的鄰苯二甲酯類化合物之一[1]。DEHP一旦被人體攝入便代謝為其單體形式MEHP(鄰苯二甲酸-單-2-乙基己基酯)，而MEHP更易被人體吸收進(jìn)而影響人體健康。

已知DEHP及其代謝產(chǎn)物是機(jī)體內(nèi)分泌干擾物，其宮內(nèi)暴露可誘導(dǎo)子代神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，造成子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降[2-4]。目前已知許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病與線粒體動態(tài)失衡相關(guān)[5]，其可導(dǎo)致阿茲海默綜合征及亨廷頓舞蹈癥等[6,7]，智力損傷也與線粒體動態(tài)失衡有關(guān)[8]。因此，線粒體動態(tài)學(xué)改變是否在DEHP致子代大鼠神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用是本文研究的重點(diǎn)。

1材料與方法

1.1主要試劑

DEHP (分析純，美國Sigma 公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，線粒體融合蛋白1(Mitofusin1，Mfn1)抗體和發(fā)動蛋白相關(guān)GTP 酶1(dynamin related GTPase 1，Drp1)抗體(美國Santa Cruz 生物公司)

1.2實驗動物分組和染毒[3]

動物染毒：取SPF級Wistar大鼠共32只，其中雌鼠24只，雄鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將雌鼠按體重隨機(jī)分為4組，雌雄大鼠以1∶1同籠，第二日晨于盤底及陰道檢查陰栓，查出陰栓者記為妊娠第0天，于妊娠第12天至第18天經(jīng)口灌胃連續(xù)染毒7天，待其自然分娩。實驗期間，大鼠自由攝食、飲水。

動物分組：每天對照組給予橄欖油，低、中和高劑量組分別給予10、100和500 mg/kg·BW DEHP。孕鼠產(chǎn)子后，單獨(dú)哺養(yǎng)幼鼠。待子鼠出生滿6周，每只孕鼠選取雌雄兩只子代大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測定。

1.3水迷宮實驗

采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮圓形水池(直徑2 m)、人為分為4個等大的象限。水池內(nèi)加水后倒入墨汁使水呈不透明狀，在其中一個象限正中放置一個直徑12 cm圓形黑色平臺，平臺隱于水面下約2.0 cm處。利用Morris水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng)記錄大鼠的游泳時間和距離。

定位航行實驗：前5天為訓(xùn)練期，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每次從不同象限入水。尋找平臺最長時間設(shè)定為1 min，平臺停留時間為15 s，若在規(guī)定的時間內(nèi)未找到平臺，則引導(dǎo)大鼠至平臺，停留15 s。第6天進(jìn)行定位航行檢測實驗，每只大鼠從平臺對側(cè)象限入水，記錄尋找平臺的時間(潛伏期)及游泳路徑長度。

空間探索實驗：定期航行實驗結(jié)束的次日進(jìn)行。撤去平臺，選擇平臺區(qū)域的對側(cè)象限放入大鼠，記錄60 s內(nèi)大鼠在平臺所在象限游泳的時間/(長度)與總時間(長度)的比。

1.4仔鼠海馬Mfn1和Drp1 mRNA水平的檢測

取仔鼠海馬，利用TRIzol提取mRNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以cDNA為模板加入相應(yīng)反應(yīng)體系的試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：Mfn1上游引物為；5’-GCT GCA TAC AGA CAG ACA GCCT- 3’，下游引物為5’-GGT AAT GAC CTG TCT CAG GGC T-3’，產(chǎn)物濃度183bp；Drp1上游引物為5’-GGTGGAATTGGAGATGGTGGTCGA-3’，下游引物5’-TTCGTGCAACTGGAAGTGGCACA，產(chǎn)物濃度199 bp；β- actin上游引物為5’-AGT GGT GGC ACT AAT GGA G- 3’，下游引物為5’-TCT TTT GTC AGG GGT CGT TC- 3’，產(chǎn)物長度476 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min終止反應(yīng)。電泳產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀上進(jìn)行吸光度掃描，采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.5仔鼠海馬Mfn1和Drp1 蛋白水平的檢測

利用Western blot法檢測Mfn1和Drp1蛋白水平，取海馬組織與裂解液放入勻漿器中，冰上充分研磨后，4℃10 000 g離心15 min，上清為蛋白質(zhì)。利用BCA蛋白定量試劑盒定量，98℃變性10 min。采用SDS-Page電泳分離不同分子量蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后分別用Mfn1和Drp1抗體于4℃孵育過夜。洗膜后分別加入二抗孵育1小時，利用凝膠成像儀顯示蛋白條帶，用Quantity one軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2.1DEHP對仔鼠定位航行能力影響

結(jié)果見表1，中、高劑量組潛伏期和游泳長度均明顯高于對照組和低劑量組(P<0.05)，高劑量組大鼠潛伏期和游泳長度均明顯高于中劑量組(P<0.05)，對照組與低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1不同劑量DEHP暴露仔鼠定位航行能力的差異

組別潛伏期(s)長度(cm)對照13.14±3.25257.43±53.22低劑量15.33±4.18299.75±72.13中劑量22.32±5.11*#450.37±75.42*#高劑量29.97±3.66*#^590.61±67.40*#^F17.11725.273P0.0000.000

注：*與對照組相比，P<0.05；#與低劑量組相比，P<0.05；^與中劑量組相比，P<0.05。

2.2DEHP對仔鼠空間探索能力影響

如表2所示，中、高劑量組平臺所在象限游泳的時間/(長度)與總時間(長度)的比均明顯低于對照組和低劑量組(P<0.05)，對照組與低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2不同劑量DEHP暴露仔鼠定位航行能力的差異

組別平臺所在象限時間/總時間(%)平臺所在象限長度/總長度(%)對照30.57±3.9128.41±2.88低劑量31.24±3.8828.55±3.04中劑量24.32±4.07*#21.35±3.42*#高劑量20.37±3.70*#20.18±2.96*#F8.94210.560P0.0010.000

注：*與對照組相比，P<0.05；#與低劑量組相比，P<0.05。

2.3DEHP對仔鼠海馬Mfn1和Drp1 mRNA的影響

如表3和圖1所示，相對于對照組及低劑量，中、高劑量組Mfn1 mRNA水平明顯下降(P<0.05)，而Drp1 mRNA水平明顯上升(P<0.05)，高劑量組Mfn1 mRNA水平低于中劑量組(P<0.05)，而Drp1mRNA水平高于中劑量組(P<0.05)。

表3不同劑量DEHP暴露仔鼠Mfn1和Drp1 mRNA水平

組別Mfn1Drp對照0.28±0.050.22±0.05低劑量0.27±0.040.19±0.02中劑量0.17±0.03*#0.47±0.11*#高劑量0.09±0.03*#^0.64±0.13*#^F28.91428.017P0.0000.000

注：*與對照組相比，P<0.05；#與低劑量組相比，P<0.05；^與中劑量組相比，P<0.05。

圖1　不同劑量DEHP組仔鼠Mfn1和Drp1 mRNA水平

2.4DEHP對仔鼠海馬Mfn1和Drp1 蛋白的影響

如表4和圖2所示，相對于對照組及低劑量，中、高劑量組Mfn1蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而Drp1蛋白水平明顯上升(P<0.05)，高劑量組Drp1蛋白水平高于中劑量組(P<0.05)。

表4不同劑量DEHP暴露仔鼠Mfn1和Drp1 蛋白水平

組別Mfn1Drp對照0.56±0.060.38±0.07低劑量0.58±0.180.40±0.12中劑量0.32±0.10*#0.59±0.07*#高劑量0.27±0.10*#0.75±0.07*#^F9.03721.250P0.010.000

注：*與對照組相比，P<0.05；#與低劑量組相比，P<0.05；^與中劑量組相比，P<0.05。

圖2　不同劑量DEHP組仔鼠Mfn1和Drp1蛋白水平

3結(jié)論

DEHP可通過胃腸道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚進(jìn)入機(jī)體，其中胃腸道是最主要的途徑，其進(jìn)入機(jī)體后可在胰腺酶等的作用下轉(zhuǎn)化為MEHP，進(jìn)而被吸收，吸收后的DEHP及MEHP主要分布于血液、肝臟、腎臟、胃腸道及脂肪組織[9]。DEHP的急性毒性較低，但其慢性毒性可對多種器官組織造成損傷。另外，研究發(fā)現(xiàn)孕婦廣泛暴露于DEHP[10]，其不但可對母體造成損傷，還可致子代肥胖[11]和腎臟損傷[12]。前期對DEHP的神經(jīng)毒性的研究較少，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露的子鼠，神經(jīng)系統(tǒng)明顯受到損害，學(xué)習(xí)記憶能力等受到損傷[2-4]。而本研究也通過morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)暴露于DEHP的子代大鼠其定位航行能力及空間探索能力均受到損傷，神經(jīng)行為發(fā)生了改變。

DEHP對子代大鼠神經(jīng)行為的影響有多種機(jī)制，其可通過干擾神經(jīng)類固醇CYP19A1 芳香化酶基因的轉(zhuǎn)錄[2]，抑制海馬內(nèi)突觸可塑性相關(guān)蛋白基因[4]等損失神經(jīng)細(xì)胞，而線粒體動態(tài)學(xué)改變與DEHP致子代大鼠神經(jīng)損傷之間的關(guān)系卻未見報道。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ATP的重要細(xì)胞器，其也是一種動態(tài)的細(xì)胞器，它的數(shù)量和形態(tài)都是可變的，處在一種不斷分裂和融合的動態(tài)平衡中，維持著細(xì)胞的正常功能，促進(jìn)機(jī)體的生長和代謝，當(dāng)線粒體動態(tài)平衡打破時，線粒體便無法保障細(xì)胞的正常功能。線粒體動態(tài)平衡對保證神經(jīng)元末梢長距離運(yùn)輸和能量平均分布十分重要的，因此，線粒體融合分裂異常是許多神經(jīng)變性疾病的致病因素之一，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)線粒體動態(tài)學(xué)改變與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病有關(guān)[5]，已證實線粒體分離基因Drp1在氟中毒大鼠表達(dá)明顯上升，與大腦神經(jīng)細(xì)胞損失密切相關(guān)[13]，因此，DEHP及代謝產(chǎn)物對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用是否與線粒體動態(tài)失衡有關(guān)，是本研究的探索目的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEHP暴露的子代大鼠線粒體融合基因Mfn1的基因和蛋白表達(dá)水平明顯下降，分裂基因Drp1的基因和蛋白表達(dá)水平明顯上升，證實DEHP在損傷神經(jīng)細(xì)胞的過程中確實發(fā)生了線粒體動態(tài)失衡。

綜上所述，宮內(nèi)暴露于DEHP的子代大鼠神經(jīng)行為學(xué)發(fā)生明顯改變，線粒體動態(tài)失衡可能參與了這一過程。

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Role of mitochondrial dynamic changes in DEHP-induced nerve injury of rat offspring

CHUYang,HUANGXiao-li,CUIZhuang.

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of mitochondrial dynamic changes in DEHP-induced nerve injury of rat offspring.MethodsThe pregnant mice were administered with different concentrations of DEHP.Positioning navigation and space exploration experiments was used to detect the neural behavior of 6 months old offspring rats.Enzyme-linked immunosorbent method (PCR) method and immune protein (Western blot) assay was used to detected the mRNA and protein levels of mitochondrial fusion genes Mfn1 and fission genes Drp1.ResultsIn the offspring rats of DEHP intrauterine exposure,Latency for seeking submarine platform was significantly prolonged(P<0.05),and the length of the swimming route was increased(P<0.05).The ratio of time / (length) and total length (length) of the platform is obviously decreased (P<0.05).The mRNA and protein levels of the fusion gene Mfn1 were significantly decreased (P<0.05),while the expression levels of mRNA and protein in the Drp1 were significantly increased (P<0.05).ConclusionIntrauterine exposure to DEHP can induce nerve injury in rats,and the changes of neural behavior may be caused by the imbalance of mitochondrial dynamics.

Key words:DEHP;nerve;mitochondrial dynamic changes;rat;water maze

(收稿日期：2015-09-19)

中圖分類號：R741.02

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)04-0525-04