蓮子心脂溶性生物堿的分離、鑒定

李　萍，　楊光明，　張玉玲，　顧子楊，　李　萌，　潘　揚(yáng)（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046）

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蓮子心脂溶性生物堿的分離、鑒定

李萍，楊光明，張玉玲，顧子楊，李萌，潘揚(yáng)*
（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046）

摘要：為進(jìn)一步分離并鑒定保健食品蓮子心中活性脂溶性生物堿，根據(jù)脂溶性成分和酚性生物堿的化學(xué)性質(zhì)，先將蓮子心脂溶性成分提取、分離酚性和非酚性二個(gè)部位；再運(yùn)用多種柱色譜技術(shù)分別對(duì)這二個(gè)提取部位進(jìn)行分離純化，并對(duì)所得化合物的理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)（UV，IR，MS，1H NMR、13C NMR及其2D-NMR）進(jìn)行分析歸納，最終確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從蓮子心脂溶性部位共獲得12個(gè)單體化合物，經(jīng)鑒定其中10個(gè)成分為生物堿。酚性部位有6個(gè)化合物，分別為：l-薄荷醇（l- menthol，1），甲基蓮心堿（neferine，2），亞美罌粟堿（amepavine，3），4'-甲氧基-N-甲基衡州（4'-methoxy-N-methyl coclaurine，4），異蓮心堿（isoliensinine，5），蓮心堿（liensinine，6）；非酚性部位有6個(gè)化合物，分別為：谷甾醇（sitosterol，7），荷葉堿（nuciferine，8），前荷葉堿（pronuciferine，9），蓮明堿（lysicamine，10），N-甲氧基頭花千金藤二酮B（N-methoxycepharadione B，11）和N-甲基紫堇定（N-methylcordaldine，12）。其中1、4、10、11和12則為該植物中首次發(fā)現(xiàn)的化合物。

關(guān)鍵詞：蓮子心；脂溶性生物堿；4'-甲氧基-N-甲基衡州烏藥堿；l-薄荷醇；蓮明堿；N-甲氧基頭花千金藤二酮B（N-methoxycepharadione B）；N-甲基紫堇定

蓮子心是常用保健食品，民間一般以泡茶飲，來源于睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn種子的綠色幼葉及胚根，收載于現(xiàn)版《中國(guó)藥典》中［1-3］。其主要的有效成分為異喹啉生物堿，按結(jié)構(gòu)類型可將它們分成種［4］，而按酸堿度分可簡(jiǎn)單分為非酚性和酚性生物堿2種。從蓮子心中提取生物堿的研究具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好運(yùn)用前景，至今總堿的提取工藝優(yōu)化還是關(guān)注熱點(diǎn)［5］，而弄清其有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的基礎(chǔ)工作則相對(duì)薄弱。在早期實(shí)驗(yàn)研究中，獲得了1個(gè)蓮子心中水溶性季銨堿［6］和3個(gè)雙芐基異喹啉生物堿［7］，并對(duì)其光（波）譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的解析。近年來，對(duì)蓮子心中非酚性生物堿和非生物堿類成分進(jìn)行了分離鑒定［8］，也發(fā)現(xiàn)蓮子心異喹啉生物堿具有明顯的改善糖尿病胰島素抵抗［9-11］和防治心血管疾病的作用［12-13］。為進(jìn)一步探索保健食品蓮子心中的活性成分，對(duì)其脂溶性生物堿進(jìn)行了進(jìn)一步提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定。根據(jù)脂溶性成分和酚性生物堿的化學(xué)性質(zhì)，先將蓮子心脂溶性生物堿分成酚性和非酚性2個(gè)部位；再運(yùn)用多種柱色譜技術(shù)分別對(duì)這2個(gè)提取部位進(jìn)行分離純化，對(duì)所得化合物的理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析歸納后，最終確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1　材料與方法

AV-500和ACF-300型核磁共振光譜儀：瑞士Bruker公司產(chǎn)品；UV2401 PC型紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu產(chǎn)品；IR-100 FT-IR型紅外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Nicolet公司產(chǎn)品；Micromass QTOF質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters-Micromass公司產(chǎn)品；以亮氨酸腦啡肽：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；步琦B-540型熔點(diǎn)測(cè)定儀（未校正），步琦液相中壓色譜：B-688型循環(huán)泵、B-685型分離柱和B-684型收集器，步琦B-480型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Büchi公司產(chǎn)品；安捷倫1260 Infinity型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；KH-600 DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；EPED-20 RX型反滲透純水機(jī)：南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)：美國(guó)MERCK MILLIPORE公司產(chǎn)品；202型電熱恒溫干燥箱：上海索普儀器有限公司產(chǎn)品。

TLC用硅膠板G：200～300目，試劑級(jí)，青島海洋化工廠產(chǎn)品；柱層析用硅膠：100～200目，300～400目，試劑級(jí)，安徽良臣硅源材料有限公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，TEDIA，美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；其余試劑均為AR級(jí)，水為自制超純水。

蓮子心藥材購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地為江西廣昌，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院潘揚(yáng)研究員鑒定，為睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn種子的綠色幼葉及胚根。

2　提取和分離

根據(jù)文獻(xiàn)方法［14］，取蓮子心5 kg，粉碎成粗粉（過40目篩），用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇提取，過濾，濾液回收溶劑，殘留液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸調(diào)pH 2～3，濾過，濾液先以少量乙醚脫脂，然后加濃氨水調(diào)pH 9～10使產(chǎn)生灰色沉淀，用乙醚萃取多次至提凈生物堿，即得土黃色粉塊（脂溶性總堿）28.5 g。取脂溶性總堿，用適量氯仿溶解，過濾，濾液以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氫氧化鈉溶液萃取，分取氯仿層（下層）回收溶劑，用硅膠拌勻，即得黃棕色粉塊（非酚性生物堿）8 g；分取氫氧化鈉液層（上層）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸調(diào)pH 3～4，過濾，濾液加濃氨水調(diào)pH 9～10使產(chǎn)生沉淀，再用乙醚萃取多次，合并提取液并回收溶劑，即得黃色粉塊（酚性生物堿）18.5 g。

酚性生物堿的分離：取酚性生物堿10 g，加粗硅膠拌勻，將溶液置與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干，取出干粉上硅膠常壓柱層析，v（二氯甲烷）∶v（甲醇）從100∶2到85∶15，進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，根據(jù)硅膠薄層層析、改良碘化鉍鉀液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%硫酸乙醇液顯色檢查，合并斑點(diǎn)顏色相同的洗脫液；部分合并的洗脫液如純度不高者，則再用硅膠中壓柱層析、二氯甲烷-甲醇梯度洗脫繼續(xù)進(jìn)行分離，余同上操作；最后反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物1（200 mg），2（300 mg），3（10 mg），4（5 mg），5（50 mg），6（280 mg）。

3　結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色長(zhǎng)針狀結(jié)晶（無水乙醇），微溶于水，溶于乙醇等有機(jī)溶劑。其1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、DEPT、HSQC和HMBC數(shù)據(jù)見表1。

表1　化合物1的NMR譜數(shù)據(jù)（CDCl3）Table 11H NMR（500 MHz）and13C NMR（125 MHz）data for compound 1 in CDCl3

以上數(shù)據(jù)確定了化合物1的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［15］相一致，進(jìn)而確定其為l-薄荷醇（l-menthol）。

化合物2，5和6均為淡黃色無定形粉末（乙醚），不溶于水，易溶于氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑?；衔?的TOF-ESI-MS m/z：625.317 9[M+ H]+及313.159 8[M+2H]2+，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索推斷分子式為C38H44N2O6；化合物5和6的TOF-ESI-MS m/z：611.308 2[M+H]+和611.311 3[M+H]+，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索推斷二者的分子式均為C37H42N2O6。它們的1H NMR、13C NMR和DEPT數(shù)據(jù)如表2和表3所示：

非酚性生物堿的分離，同“酚性生物堿的分離”的操作，得到化合物7（500 mg），8（90 mg），9（10 mg），10（5 mg），11（3 mg）和12（90 mg）。

表2　化合物2、5和6的1H NMR（300 MHz）譜數(shù)據(jù)（CDCl3）Table 21H NMR（300 MHz）data[δH（10-6）J（Hz）]for compound 2，5 and 6 in CDCl3

續(xù)表2

表3　化合物2、5和6的13C NMR（75 MHz）和DEPT譜數(shù)據(jù)（CDCl3）Table 313C NMR（75 MHz）and DEPT data for compound 2，5 and 6 in CDCl3

續(xù)表3

以上數(shù)據(jù)確定了化合物2、5和6的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［7］相一致，進(jìn)而確定其分別為甲基蓮心堿（neferine）、異蓮心堿（isoliensinine）和蓮心堿（liensinine）。

化合物3和4的理化性質(zhì)比較相近，均為淡黃色無定形粉末（乙醚），不溶于水，易溶于氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑?；衔?的TOF-ESI-MS m/z：314.179 6[M+H]+，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索推斷其分子式為C19H23NO3，其1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)比較如表4所示。

表4　化合物3和4的1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)比較（CDCl3）Table 31H NMR and13C NMRdata for compound 3 and 4 in CDCl3

以上數(shù)據(jù)確定了化合物3和4的結(jié)構(gòu)，3與文獻(xiàn)報(bào)道[16]相一致，確定其分別為亞美罌粟堿（amepavine）；而4與3互為同分異構(gòu)體，經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道的N-甲基衡州烏藥堿（N-methyl coclaurine）［17］的理化數(shù)據(jù)仔細(xì)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其在4'位上多出一個(gè)甲氧基，與文獻(xiàn)所述（1S）-6 -methoxy -1 -[（4 -methoxyphenyl）methyl]-2-methyl-3，4-dihydro-1H-isoquinolin-7-ol為同一物質(zhì)，具有松馳血管平滑肌的作用［18］，由于其化學(xué)命名較為復(fù)雜，因此將其俗名定為4'-甲氧基-N-甲基衡州烏藥堿（4'-methoxy-N-methyl coclaurine）。

化合物7為無色長(zhǎng)針狀結(jié)晶（無水乙醇），m. p. 140～142℃，溶于氯仿、乙醚、無水乙醇，紫外無最大吸收。1H NMR（CDCl3，300 MHz）δ：5.36（1H，br.d.，J = 5.4 Hz，H-6），3.53（1H，m，H-3），1.01（3H，s，H-19），0.92（3H，d，1= 6.42 Hz，H-26），0.85（3H，t，1= 6.42 Hz，H-29，0.84（3H，d，1= 6.9 Hz，H-21），0.81 （3H，d，1= 6.39 Hz，H-27），0.68（3H，s，H-18）。13C NMR（CDCl3，75 MHz）δ：37.2（C-1），31.7（C-2），71.8 （C-3），42.3（C-4），140.8（C-5），121.7（C-6），31.9 （C-7），31.7（C-8），50.1（C-9），36.5（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），45.8（C-13），56.0（C-14），24.3（C-15），28.2（C-16），56.8（C-17），12.0（C-18），19.4（C-19），36.1（C-20），19.0（C-21），33.9（C-22），29.2（C-23），29.7（C-24），26.1（C-25），18.8（C-26），19.8（C-27），23.1（C-28），11.8（C-29）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物7的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［8，19］相一致，因此確定其為β-谷甾醇（β-sitosterol）。

化合物8為微黃綠色針狀結(jié)晶（石油醚b. p. 30～60℃），m. p. 161～163℃，不溶于水，能溶于乙醚、氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑。TOF-ESI-MS m/z：296.382 8[M+H]+，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索推斷其分子式為C19H21NO2。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.63（1H，s，H -3），3.16（1H，m，Hβ-4），2.68（1H，dd，J = 16.15，3.65Hz，Hβ-4），3.03（1H，dd，J = 11.5，5.2Hz，Hβ-5），2.50（1H，td，J = 11.9，3.65Hz，Hβ-5），3.02 （1H，m，H-6a），3.09（1H，dd，J = 13.8，4.0 Hz，Hβ-7），2.61（1H，t，J = 12.4 Hz，Hβ-7），7.25（1H，t，J = 7.3 Hz，H-8），7.22（1H，t，J = 7.05 Hz，H-9），7.31 （1H，t，J = 7.05 Hz，H-10），8.35（1H，d，J = 7.9 Hz，H-11），3.66（3H，s，1-OCH3），3.88（3H，s，2-OCH3），2.54（3H，s，6-NCH3）。13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ： 145.3（C-1），127.0（C-1a），128.7（C-1b），152.1（C-2），111.5（C-3），128.2（C-3a），29.3（C-4），53.4（C-5），62.4（C-6），35.2（C-7），136.5（C-7a），127.3（C-8），127.9（C-9），127.0（C-10），128.4（C-11），132.2 （C -11a），60.2（1 -OCH3），56.0（2 -OCH3），44.0（6 -NCH3）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物8的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［20］相一致，因此確定其為荷葉堿（nuciferine）。

化合物9為淡黃色無定形粉末（氯仿），m. p. 128～130℃，不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷等有機(jī)溶劑。TOF-ESI-MS m/z：312.383 2[M+H]+，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索推斷其分子式為C19H22NO3。1HNMR （CDCl3，500 MHz）δ：6.68（1H，s，H-3），3.25（1H，m，Hβ-4），2.94（1H，m，Hβ-4），3.48（1H，dd，J = 11.8，7.3 Hz，Hβ-5），2.94（1H，m，Hβ-5），4.05（1H，br.s，H-6a），2.64（1H，m，Hβ-7），2.45（1H，dd，J = 12.0，6.1 Hz，Hβ-7），6.92（1H，dd，J = 5.9，2.6 Hz，H-8），6.41 （1H，dd，J = 11.6，1.9 Hz，H -9），6.29（1H，dd，J = 11.6，2.1 Hz，H-11），6.94（1H，dd，J = 6.2，2.8 Hz，H-12），3.62（3H，s，1-OCH3），3.82（3H，s，2-OCH3），2.66（3H，s，6-NCH3）。13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：144.9（C-1），132.8（C-1a），126.3（C-1b），154.3（C-2），111.9（C-3），130.3（C-3a），26.0（C-4），54.6（C-5），65.3（C-6a），45.0（C-7），50.8（C-7a），152.6（C-8），128.6（C-9），185.9（C-10），127.9（C-11），148.8 （C-12），61.0（1-OCH3），56.3（2-OCH3），41.8（6-NCH3）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物9的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［21］相一致，因此確定其為前荷葉堿（pronuciferine）。

化合物10為黃綠色無定形粉末（石油醚b. p. 30～60℃），m. p. 186～187℃，不溶于水，易溶于氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.23（1H，s，H-3），7.81（1H，d，J = 4.95 Hz，H-4），8.91（1H，d，J = 4.83 Hz，H-5），8.58（1H，d，J = 7.74 Hz，H-8），7.58（1H，t，J = 7.5 Hz，H-9），7.76 （1H，t，J = 8.14 Hz，H-10），9.18（1H，d，J = 8.25 Hz，H-11），4.11（3H，s，1-OCH3），4.02（3H，s，2-OCH3）。13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：143.9（C-1），155.5（C-2），105.1（C-3），134.9（C-3a），122.1（C-4），143.5 （C-5），155.5（C-6a），181.2（C-7），130.7（C-7a），127.0（C-8），127.3（C-9），132.9（C-10），127.5（C-111），134.1（C-11a），120.8（C-11b），122.1（C-11c），59.2（1-OCH3），54.8（2-OCH3）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物10的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［22］相一致，因此確定其為蓮明堿（lysicamine）。

化合物11為橘紅色固體（石油醚b. p. 30～60℃），m. p. 280℃（分解），不溶于水，易溶于氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑。1HNMR（CDCl3，300 MHz）δ：8.31（1H，s，H-3），7.55（1H，s，H-7），7.91（1H，dd，J = 9.51，5.85 Hz，H-8）7.68（2H，dd，J = 9.33，1.83 Hz，H-9和H-10），9.55（1H，dd，J = 9.69，4.74 Hz，H-11），4.15，4.12（各3H，s，1-OCH3和2-OCH3），3.67（3H，s，6-N-OCH3）。13CNMR（CDCl3，75 MHz）δ：114.3（C-3），113.4（C-7），128.9（C-8），127.7和

127.7（C-9或C-10），123.8（C-11），57.5（1-OCH3），56.5（2-OCH3），52.6（6-N-OCH3）（注意：由于樣品量太少，季碳的信號(hào)太弱，沒能收集到，因此未能對(duì)其進(jìn)行歸屬）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物11的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［23］相一致，因此確定其為N-甲氧基頭花千金藤二酮B（N-methoxycepharadione B）。

化合物12為無色針狀結(jié)晶（冰水），m. p. 112～113℃，能溶于氯仿、二氯甲烷、甲醇和水。1HNMR （DMSO-d6，500 MHz）δ：3.50（2H，t，J = 6.7Hz，H-3），2.89（2H，t，J = 6.7Hz，H-4），6.68（1H，s，H-5），7.36（1H，s，H-8），2.98（3H，s，2-NCH3），3.80，3.75（各3H，s，6-OCH3和7-OCH3）。13CNMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：163.7（C-1），47.7（C-3），26.8（C-4），132.2（C-4a），110.2（C-5），151.5（C-6），147.5（C-7），110.3（C-8），121.5（C-8a），34.5（2-NCH3），55.6，55.7（6-OCH3和7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)確定了化合物12的結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道［24，25］相一致，因此確定其為N-甲基紫堇定（N-methylcordaldine）。

4　結(jié)語

從蓮子心脂溶性部位共獲得并鑒定了12個(gè)單體化合物，其中9個(gè)成分為生物堿。6個(gè)酚性化合物分別為l-薄荷醇（1），甲基蓮心堿（2），亞美罌粟堿（3），4'-甲氧基-N-甲基衡州烏藥堿（4），異蓮心堿（5），蓮心堿（6）；5個(gè)非酚性化合物分別為?-谷甾醇（7），荷葉堿（8），前荷葉堿（9），蓮明堿（10），N-甲氧基頭花千金藤二酮B（11）和N-甲基紫堇定（12），他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。其中1、4、10、11和12則為該植物中首次發(fā)現(xiàn)的化合物。

圖1　從蓮子心中所得化合物1～12的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of the compounds（1-12）isolated from embryo loti

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Isolation and Identification of the Lipophilic Alkaloids of Embryo Loti

LI Ping，YANG Guangming，ZHANG Yulin，GU Zhiyang，LI Meng，PAN Yang*
（School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China）

Abstract：To further isolate and identify the lipophilic alkaloids（active ingredient）from the Chinese herb，embryo loti（the green embryo of mature seed of Nelumbo nucifera Gaertn.）. According to the chemical properties of lipophilic compounds and phenolated alkaloids，the lipophilic components of embryo loti were separated into two groups：the phenolic and the non-phenolic components. Then various column chromatographic techniques were used to isolate and purify the two components. The chemical structures of the compounds were determined from the analysis of their physicochemical properties and spectrum study，i. e.，UV，IR，MS，1H NMR，13C NMR and 2D-NMR，ect.. Tweleve different monomers were obtained from the lipophilic extraction of embryo loti，and 10 of them were identified as alkaloids. Six phenolic compounds were identified，book=20,ebook=25including l- menthol，neferine，amepavine，4'-methoxy-N-methyl coclaurine，isoliensinine and liensinine. Six non-phenolic compounds were also determined，such as -sitosterol，nuciferine，pronuciferine，lysicamine，N-methoxycepharadione B and N-methylcordaldine. Among them，lmenthol，4'-methoxy-N-methyl coclaurine，lysicamine，N-methoxycepharadione B and N-methylcordaldine were first reported here.

Keywords：Nelumbo nucifera Gaertn.，l-menthol，4'-methoxy-N-methyl coclaurine，lysicamine，N-methoxycepharadione B，N-methylcorydaldine

*通信作者：潘揚(yáng)（1964—），男，江蘇揚(yáng)州人，理學(xué)博士，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)與生物技術(shù)研究。E-mail：y.pan2006@163.com

作者簡(jiǎn)介：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373295）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk－2014）。

收稿日期：2014-11-24

中圖分類號(hào)：S 645

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0019—09