地衣腌菜中產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選與鑒定

陳秀金，　馬麗蘋，　曹　力，　任國艷，　李智麗，　李兆周，　胥傳來（.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽4703；.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫4）

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地衣腌菜中產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選與鑒定

陳秀金1，馬麗蘋1，曹力1，任國艷1，李智麗1，李兆周1，胥傳來2
（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：采用濾紙片雙層平板法從自制酸奶、市售散裝腌菜和袋裝榨菜中分離出乳酸菌，再對分離的乳酸菌進行抑菌試驗、酸和過氧化氫抑制作用的排除、蛋白酶的敏感檢測和抑菌譜測定，最后對所得菌株形態(tài)和生理生化特性進行鑒定。結(jié)果：從樣品中篩選到5株具有較高抑菌活性的乳酸菌菌株，在排除了酸和過氧化氫干擾后，發(fā)酵上清液仍有很強的抑菌作用；經(jīng)蛋白酶處理后，發(fā)酵液的抑菌活性顯著下降，說明該抑菌物具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，是一類細(xì)菌素。這5株菌對綠膿假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌均有很強的抑菌活性，并選出抑菌活性最強的菌株E2-2，初步鑒定其為戊糖乳桿菌。

關(guān)鍵詞：地衣腌菜；細(xì)菌素；乳酸菌；篩選；鑒定

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一群能分解葡萄糖或乳糖等碳水化合物產(chǎn)生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數(shù)無動力，過氧化氫酶陽性的無芽孢桿菌和球菌，在自然界分布廣泛，在代謝過程中會產(chǎn)生一些對食源性致病菌和腐敗菌具有抑菌活性的物質(zhì)如有機酸、過氧化氫和細(xì)菌素等[1]。乳酸菌細(xì)菌素（Bacteriocin of LAB）是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，不僅能抑制與其親緣關(guān)系相近的乳酸菌，而且對非乳酸菌的革蘭氏陽性菌也有一定的抑制作用[2]。由于乳酸菌細(xì)菌素具有高效、安全和無抗藥性、可以被體內(nèi)的蛋白酶分解，并且能夠抑制或殺死食品中的一些病原菌和腐敗菌。因此，它被認(rèn)為是一種具有潛在應(yīng)用價值的天然食品防腐劑，將來有可能取代抗生素發(fā)揮作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的研究價值[3-4]。據(jù)報道，目前分離產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的材料有傳統(tǒng)的發(fā)酵食品（泡菜、酸奶、香腸和火腿）、動物腸道（雞腸道和扇貝腸道）、健康嬰兒的糞便和自然生境（土壤、水源和樹葉等）[5-7]。分離出產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的種屬主要有乳桿菌屬（Lactobacillin）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）等，其中乳桿菌屬中報道最多的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌種屬是植物乳桿菌（Lactobacillin plantarum）[8-10]，而戊糖乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的報道則比較少[11]。另外在實際應(yīng)用中，乳酸菌細(xì)菌素還存在著種類少、抑菌譜窄和產(chǎn)量低的問題亟待解決[12]。因此，作者從自制酸奶、市售泡菜和袋裝榨菜中分離出產(chǎn)廣譜、高效細(xì)菌素的乳酸菌，通過形態(tài)和生理生化特征進行鑒定，為今后開發(fā)新型安全的天然食品防腐劑奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1分離樣品酸奶由河南科技大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實驗室自制；腌菜（黃瓜、地衣菜、蘿卜絲、蘿卜條、白菜）及各種不同風(fēng)味的袋裝榨菜均購自洛陽市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2主要試劑蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物均購自Sigma公司；堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶購自龐博生物有限公司；其他試劑均購自阿拉丁試劑有限公司，未特殊說明均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；糖發(fā)酵培養(yǎng)基；淀粉水解培養(yǎng)基；無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基；M.R.實驗培養(yǎng)基；V.P.實驗培養(yǎng)基；明膠液化培養(yǎng)基；蛋白胨氨化培養(yǎng)基；產(chǎn)硫化氫實驗培養(yǎng)基；硝酸鹽還原培養(yǎng)基；蛋白胨水解培養(yǎng)基；苯丙氨酸脫氫酶培養(yǎng)基。

1.1.4供試指示菌大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：作者所在實驗室保存。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上?？茣詢x器有限公司產(chǎn)品；TE412-L分析電子天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJIPO超凈工作臺：蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；TDL-60B臺式低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器廠產(chǎn)品；DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；PHS-3B酸度儀：廣州粵鳳儀器有限公司產(chǎn)品；HWS24恒溫水浴鍋：江蘇金壇榮華儀器廠產(chǎn)品；XHC-BG倒置生物顯微鏡：北京華測科學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.3乳酸菌的分離純化

將自制酸奶、市售散裝腌菜（黃瓜、地衣菜、蘿卜絲、蘿卜條）和袋裝榨菜按一定量分別加到含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%蛋白胨和0.8%氯化鈉的溶液中勻漿，30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，進行增菌[13]；然后采用10倍稀釋法進行稀釋，每個樣品配制了5個稀釋度，分別為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5[14]；再移取一定量的菌懸液與含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基混合，搖勻，自然冷卻凝固，30℃下恒溫培養(yǎng)48 h，挑選出能使培養(yǎng)基由藍變黃的菌落[15]。采用紙層析法對分離菌的代謝產(chǎn)物乳酸進行定性測定；結(jié)合革蘭氏染色法和鏡檢，篩選乳酸菌，并對挑選出的乳酸菌平板劃線純化3次，培養(yǎng)斜面，4℃保存，備用。

1.4產(chǎn)抑菌物乳酸菌的初篩

將活化的乳酸菌接種到含有1 mL改良MRS液體培養(yǎng)基的PE管中，30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的接種量接種到改良MRS液體培養(yǎng)基中，30℃下恒溫培養(yǎng)48 h，離心（12 000 r/min，9 min），得到發(fā)酵上清液，采用濾菌器對其過濾除菌，4℃下保存，備用。以綠膿假單胞桿菌為指示菌，采用濾紙片雙層平板法進行抑菌試驗。具體步驟如下：量取0.1 mL指示菌菌液（菌懸液濃度為10-7cfu/mL）與冷卻到50℃左右的上層培養(yǎng)基混勻，倒入鋪有下層培養(yǎng)基的平皿中，冷卻凝固后，每個平板均勻地放上3～6個濾紙片，每個濾紙片定量添加100 μL的發(fā)酵上清液，同時標(biāo)注菌株，在4℃冰箱中放置4 h，使菌液緩慢地擴散到培養(yǎng)基中，然后在30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，選取菌落周圍抑菌圈直徑較大的菌株進行復(fù)篩。每個菌株均做4個平行試驗，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑的大小，求平均值。

1.5產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

為了進一步確定乳酸發(fā)酵上清液對指示菌的抑制作用不是其他代謝產(chǎn)物（如有機酸、過氧化氫等）的作用結(jié)果，而是乳酸菌細(xì)菌素作用的結(jié)果，所以要進行復(fù)篩。

1.5.1酸抑制作用的排除按照1.4所述方法制備發(fā)酵上清液，測定其pH值。采用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液將發(fā)酵上清液pH值分別調(diào)至3.0，4.0，4.5，5.0，6.0；再用乳酸和鹽酸溶液將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)整到設(shè)定的對照pH值[16-17]；采用濾紙片雙層平板法對綠膿假單胞桿菌進行抑菌試驗，選擇抑菌圈稍微變小或不變的菌株進行下一步試驗。

1.5.2過氧化氫抑制作用的排除按照1.4所述的方法制備發(fā)酵上清液，然后將其置于80℃水浴中保溫10 min[18]，采用濾紙片雙層平板法對綠膿假單胞桿菌進行抑菌試驗，選擇抑菌圈變化小或不變的菌株進行下一步試驗。

1.5.3蛋白酶的敏感檢測選擇堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對乳酸菌所產(chǎn)抑菌物進行酶解試驗，以確定乳酸菌所產(chǎn)抑菌物是否具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。先用1 mol/L NaOH溶液將發(fā)酵上清液pH值調(diào)到6.0～7.5（即蛋白酶作用的pH值范圍），再將堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶溶液在攪拌狀態(tài)下緩慢加入到發(fā)酵上清液中，使酶的終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，在30℃水浴中保溫2 h，再將pH值調(diào)回到原發(fā)酵液pH值，采用濾紙片雙層平板法對綠膿假單胞桿菌進行抑菌試驗，選擇抑菌圈明顯變小或消失的菌株進行下一步試驗。

1.6產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌抑菌譜的測定

采用濾紙片雙層平板法對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿假單胞桿菌進行抑菌試驗，以確定選出乳酸菌的抑菌譜。

1.7產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

試驗結(jié)合菌落和菌體的形態(tài)特征、生理生化特性的試驗結(jié)果，按照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗方法》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對選出乳酸菌的種屬進行了初步鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離結(jié)果

從30種樣品中分離出能使改良MRS培養(yǎng)基由藍變黃的產(chǎn)酸菌95株，結(jié)合紙層析法、革蘭氏染色法和鏡檢結(jié)果，選出革蘭氏染色陽性，桿菌，并且產(chǎn)乳酸菌的菌株共33株。

2.2初篩的結(jié)果

從上述33株乳酸菌中，篩選出對綠膿假單胞桿菌有抑制作用菌株10株，這些菌株的編號分別為E1-1、E1-2、E1-3、E1-4、E1-5、E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5。不同菌株對綠膿假單胞桿菌的抑制作用差異較大，選擇抑菌圈直徑大于10 mm的5株菌株E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5進行后續(xù)試驗。

2.3復(fù)篩的結(jié)果

2.3.1排除有機酸作用的抑菌結(jié)果按照1.5.1所述的方法對初篩乳酸菌酸抑制作用的干擾進行了研究，結(jié)果見圖1。

由試驗結(jié)果結(jié)合圖1可得，當(dāng)發(fā)酵上清液pH值調(diào)到4.0時，對供試指示菌有明顯的抑菌作用，其抑菌圈直徑在11.4～17.8 mm之間；而乳酸、鹽酸調(diào)整到同樣pH值的MRS培養(yǎng)基對指示菌卻幾乎沒有抑菌作用，說明主要抑菌活性物質(zhì)不是酸性產(chǎn)物。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵上清液的pH＞5時，發(fā)酵上清液的抑菌活性開始下降，說明菌株所產(chǎn)細(xì)菌素在酸性條件下更有利于抑菌活性的發(fā)揮，這和Zacharof等人得出的結(jié)論相吻合[19]。

圖1　排除有機酸作用對抑菌活性的影響Fig. 1 Exclusion of interference from acid

2.3.2過氧化氫作用的排除按照1.5.2所述的方法對初篩乳酸菌進行了過氧化氫抑制作用的排除試驗，結(jié)果見圖2。

圖2　過氧化氫排除作用對抑菌活性的影響Fig. 2 Exclusion of interference from hydrogen peroxide

因為過氧化氫對熱不穩(wěn)定，發(fā)酵液經(jīng)熱處理后過氧化氫就會分解。由圖2可見，水浴后的發(fā)酵上清液仍有明顯的抑菌效果，說明過氧化氫不是發(fā)酵液中的主要抑菌活性物質(zhì)，發(fā)酵液中還存在其他的抑菌物。同時還可以看出，菌株E2-1、E2-2、E2-4經(jīng)水浴后抑菌圈直徑下降的幅度比較小。

2.3.3蛋白酶的敏感檢測按照1.5.3所述的方法對菌株E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5發(fā)酵上清液采用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶處理，結(jié)果見圖3。

圖3　蛋白酶敏感的測定結(jié)果Fig. 3 Determination of proteinase susceptibility

由圖3可見，菌株E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5發(fā)酵液所產(chǎn)的抑菌活性物質(zhì)能夠被堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分解，故酶解后抑菌圈的直徑顯著變小，說明乳酸菌發(fā)酵液中的主要抑菌活性物具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，可以確定是一類細(xì)菌素[20]。同時還可以看出，復(fù)合蛋白酶對抑菌活性物水解的更徹底。

2.4產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌抑菌譜的測定

測定產(chǎn)細(xì)菌素菌株E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5對4種指示菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞桿菌）的抑菌效果，結(jié)果見圖4。

圖4　菌株抑菌譜的測定結(jié)果Fig. 4 Antibacterial spectrum determination of strains

由圖4可以看出：菌株E2-1、E2-2、E2-3、E2-4、E2-5對4種指示菌大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌效果，除了菌株E2-3外，其他菌株均對綠膿假單胞桿菌的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最弱。比較不同菌株的抑菌效果，菌株E2-2的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好，故選菌株E2-2進行下一步試驗。

2.5產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

2.5.1形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果菌株E2-2在MRS培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24 h，菌落特征表現(xiàn)為菌落直徑約1.2 mm、表面光滑、呈圓形、微突起、呈梭形、邊緣整齊、顏色為乳白色、內(nèi)亮外模糊、不透明。革蘭氏染色結(jié)果為G+；鏡檢其形狀為桿菌。

2.5.2生理生化特性菌株E2-2的接觸酶陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，無運動性，不產(chǎn)硫化氫，pH 4.5下能生長，確定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖；M.R.試驗、產(chǎn)氨試驗均為陽性，淀粉水解、V.P.試驗、明膠、吲哚、過氧化氫、硝酸鹽還原、纖維素水解、產(chǎn)硫化氫、苯丙氨酸脫氫酶的試驗均為陰性，牛奶分解酸凝。

結(jié)合以上形態(tài)學(xué)及生理生化特性，對照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗方法》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，初步鑒定菌株E2 -2為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

3　結(jié)語

從自制酸奶、市售泡菜和袋裝榨菜中分離出33株乳酸菌；以綠膿假單胞桿菌為指示菌，采用濾紙片雙層平板法選出具有抑菌作用的菌株10株，并選擇其中抑菌圈直徑大于10 mm的5株菌株進行酸抑制和過氧化氫干擾排除，蛋白酶解試驗后，發(fā)現(xiàn)乳酸菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)不是酸性產(chǎn)物或過氧化氫，易于被堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解，是一類細(xì)菌素。這5株菌不僅對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿假單胞桿菌）具有抑菌作用，而且對革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌）具有抑菌作用，說明其具有廣譜性。并選出抑菌活性高且抑菌譜廣的菌株E2-2，根據(jù)菌體、菌落形態(tài)特征和生理生化特性的實驗結(jié)果，初步鑒定其為戊糖乳桿菌。菌株E2-2分離于河南的傳統(tǒng)腌制食品——地衣菜，目前尚未見從地衣腌菜中分離篩選出產(chǎn)高效廣譜細(xì)菌素的文獻報道。下一步將準(zhǔn)備對該菌株所產(chǎn)細(xì)菌素進行分離純化和特性研究，為其將來用作食品的綠色防腐劑提供一定的理論依據(jù)。

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Screening and Identification of Broad-Spectrum Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria in Lichene Pickles

CHEN Xiujin1，MA Liping1，CAO Li1，REN Guoyan1，LI Zhili1，LI Zhaozhou1，XU Chuanlai2
（1. Food and Bioengineering Institute，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China；2. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：A high-efficient and broad-spectrum bacteriocin was developed as a natural food preservative. The lactic acid bacteria were isolated from the home-made yogurt，the marketed unpackaged pickles and the bagged pickles，respectively，using the scrip double-layer plate assay. The isolated lactic acid bacteria was processed by bacteriostasis test，the inhibitory effect test of acid and hydrogen peroxide scavenging，the susceptibility detection of proteinase，and the antibacterial spectrum determination. Finally，the morphologies as well as the physiological and biochemical characteristics of strains were identified. Five lactic acid bacteria strains with higher antimicrobial activity were successfully isolated. Their fermentation supernatants obtained great antimicrobial activity after the exclusion of interference from acid and hydrogen peroxide，while a decrease of the antimicrobial activity was observed after proteinase treatment. The results indicated the isolated strains were proteinaceous bacteriocin. Five strains exhibited high antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis and Escherichiacoli. The strainbook=43,ebook=48E2-2 was selected as the strain of the best antimicrobial activity，which was preliminarily identified as Lactobacillus pentosus.

Keywords：lichene pickles，bacteriocin，lactic acid bacteria，screening，identification

作者簡介：陳秀金（1977—），女，山西臨猗人，工學(xué)博士，副教授，主要從事食品微生物篩選、鑒定與檢測研究。E-mail：chenxiujin9610@126.com

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAC01B07）；河南科技大學(xué)博士科研啟動基金資助項目（09001789）。

收稿日期：2014-11-18

中圖分類號：Q 93-3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0042—06