胃癌p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

白艷麗++金建軍++劉獻(xiàn)民等

【摘要】 目的 檢測(cè)胃癌組織中p16基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)， 并分析其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法 應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)對(duì)42例胃癌組織（胃癌組）、42例癌前病變組織（癌前病變組）、60例正常對(duì)照胃黏膜組織（健康對(duì)照組）中p16基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)合臨床病理資料， 分析其在胃癌發(fā)生、進(jìn)展中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果 42例胃癌組織中p16基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化陽性率為52.4%， 癌前病變組織中為11.9%， 正常組織中為1.7%， 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低分化型胃癌組織中p16基因甲基化陽性率明顯高于高分化與中分化型胃癌組織， 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中p16基因甲基化陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。結(jié)論 p16基因甲基化在胃癌發(fā)生的促進(jìn)和進(jìn)展階段也發(fā)揮著重要作用， 對(duì)早期胃癌診斷具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 胃癌；p16基因；甲基化

DNA甲基化是目前研究最為深入一種表觀遺傳學(xué)形式[1]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）研究胃癌及癌前病變中p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況， 旨在了解胃癌中p16基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與胃癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系， 以認(rèn)識(shí)p16基因甲基化與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年10月～2015年7月收治的42例胃癌組織標(biāo)本作為胃癌組， 其中男27例， 女15例；高/中分化25例， 低分化17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例， 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例。所有患者均經(jīng)病理確診， 且組織標(biāo)本前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。選取本院同期收治的42例癌前病變胃鏡活檢標(biāo)本作為癌前病變組， 包括慢性萎縮性胃炎伴中-重度腸上皮化生18例， 慢性萎縮性胃炎伴中-重不典型增生14例， 中-重腸上皮化生合并中-重不典型增生10例。男27例， 女15例。另取60例胃鏡檢查的健康人或慢性淺表性胃炎患者作為健康對(duì)照組， 排除妊娠、外傷、慢性病毒性肝炎及風(fēng)濕免疫性疾病。男28例， 女32例。

1. 2 標(biāo)本采集及DNA提取 標(biāo)本取下后， 置入做好標(biāo)記的凍存管中， 立即投入液氮。保存于-80℃冰箱， 以備后用。樣本DNA提取：采用TIANamp Macro DNA Kit（天根）試劑盒， 嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行。應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold KitTM對(duì)所得血漿循環(huán)DNA樣本及人甲基化基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品（天恩澤）進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。

1. 3 甲基化特異性PCR p16基因甲基化（M）和非甲基化（U）序列的特異性引物由上海生工公司合成。瓊脂糖凝膠電泳判定PCR產(chǎn)物。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 MSP產(chǎn)物判定 甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶（無論非甲基化引物能否擴(kuò)增出目的條帶）作為陽性結(jié)果；非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶且甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶作為陰性結(jié)果。

2. 2 胃癌組與癌前病變組、健康對(duì)照組p16基因甲基化狀態(tài)比較 胃癌組42例標(biāo)本中， 22例為甲基化， 陽性率為52.38%；癌前病變組42例標(biāo)本中， 5例為甲基化， 陽性率為11.90%；對(duì)照組60例標(biāo)本中， 1例為甲基化， 陽性率為1.67%， 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.91， P<0.001）， 由正常、癌前病變到胃癌的轉(zhuǎn)化過程中p16基因甲基化陽性率呈逐步增加的趨勢(shì)。

2. 3 胃癌組不同臨床病理特征與p16基因甲基化狀態(tài)的關(guān)系 不同年齡、性別組間的胃癌組織p16基因甲基化陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；低分化型胃癌組織中p16基因甲基化陽性率82.4%（14/17）明顯高于高分化與中分化型胃癌組織32.0%（8/25）， 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中p16基因甲基化陽性率80.0% （16/20）明顯高于無轉(zhuǎn)移組37.5%（6/16）。

3 討論

DNA甲基化是指在DNA雙螺旋中， DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下， S-腺苷甲硫氨酸中的活性甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基的過程， 其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。p16基因的功能產(chǎn)物， p16基因的失活存在于大多數(shù)腫瘤中， 失活機(jī)制包括基因的缺失和啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化[2]。本研究發(fā)現(xiàn)， 在由正常、癌前病變到胃癌的轉(zhuǎn)化過程中p16基因甲基化陽性率呈逐步增加的趨勢(shì)， 提示p16基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化可能是發(fā)生于胃癌早期的分子事件之一。低分化組、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組p16基因甲基化率顯著高于高/中分化組、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組， 提示p16基因甲基化在胃癌發(fā)生的促進(jìn)和進(jìn)展階段也發(fā)揮著重要作用。

腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)異?？赡茉谀[瘤發(fā)生的啟動(dòng)、促進(jìn)和進(jìn)展階段均發(fā)揮著重要作用。這種CpG島高甲基化異常在腫瘤預(yù)防和治療中均有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。DNA甲基化在腫瘤診斷、化療敏感性和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用價(jià)值已得到重視。發(fā)生DNA甲基化的腫瘤比DNA序列突變腫瘤， 遺傳性損傷容易糾正， 經(jīng)去甲基化治療特異性地糾正過來， 繼而恢復(fù)其表達(dá)狀態(tài)， 已被認(rèn)為是極有發(fā)展前景的腫瘤治療的新手段[4-6]。

參考文獻(xiàn)

[1]劉文天， 焦煥利， 楊玉龍， 等. p16基因高甲基化在胃癌發(fā)展中的作用.世界華人消化雜志， 2007， 15（26）：2839-2843.

[2]Morris MR， Ricketts CD， Abdulrahman M， et al. Identification of candidate tumour suppressor genes frequently methylated in renal cell carcinoma. Oncogene， 2010， 29（14）：2104-2117.

[3]Peng D， Zhang H， Sun G. The relationship between P16 gene promoter methylation and gastric cancer： a meta-analysis based on Chinese patients. J Cancer Res Ther， 2014， 10 Suppl（8）：292-295.

[4]Zhang P， Pollock RE. Epigenetic Regulators： New Therapeutic Targets for Soft Tissue Sarcoma. Cancer Cell Microenviron， 2015， 1（4）：e191.

[5]Kang N， Shah VH， Urrutia R. Membrane-to-Nucleus Signals and Epigenetic Mechanisms for Myofibroblastic Activation and Desmoplastic Stroma： Potential Therapeutic Targets for Liver Metastasis？ Mol Cancer Res， 2015， 13（4）：604-612.

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[收稿日期：2016-01-22]