豆清發(fā)酵液中一株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸球菌的分離鑒定

孫　菁，張臣飛，尹樂斌，2，孔小婷，周新星，夏秋良，趙良忠

（1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南邵陽(yáng)　422000；2.豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地建設(shè)，湖南邵陽(yáng)　422000）

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豆清發(fā)酵液中一株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸球菌的分離鑒定

孫菁1，張臣飛1，*尹樂斌1，2，孔小婷1，周新星1，夏秋良1，趙良忠1

（1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南邵陽(yáng)422000；2.豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地建設(shè)，湖南邵陽(yáng)422000）

摘要：從豆制品生產(chǎn)副產(chǎn)物豆清發(fā)酵液中分離得到1株產(chǎn)細(xì)菌素球狀菌，編號(hào)SQ- 12- 3。結(jié)合菌株生長(zhǎng)特征、菌體形態(tài)及生理生化性質(zhì)，初步將其鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。排除發(fā)酵液中可能存在的有機(jī)酸、過(guò)氧化氫及菌株菌體的干擾，并檢測(cè)抑菌物質(zhì)蛋白酶穩(wěn)定性，可確定菌株SQ- 12- 3產(chǎn)細(xì)菌素抑菌。研究該菌株產(chǎn)細(xì)菌素動(dòng)態(tài)，確定菌株最適生長(zhǎng)溫度在37℃，菌株在該溫度下發(fā)酵18 h后菌液pH值低至4.11；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7％時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制。

關(guān)鍵詞：乳酸球菌；細(xì)菌素；豆清發(fā)酵液

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱，在自然界中分布廣泛，并在利用乳糖等發(fā)酵糖[1]的代謝過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素和二乙酰等具有抑制腐敗菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，是健康人和動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群之一，對(duì)于維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)定與健康發(fā)揮著重要的作用[2-4]。細(xì)菌素是細(xì)菌代謝過(guò)程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對(duì)同種或親緣關(guān)系較近的、有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)，而具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素很少見。乳酸菌可產(chǎn)細(xì)菌素，乳酸菌細(xì)菌素是一種殺菌蛋白或多肽,可抑制廣譜的革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其是抑制一些腐敗菌和病原菌且與鰲合劑結(jié)合，可以將其活性譜拓寬到革蘭氏陰性菌，因而為食品加工和食品保藏提供了一個(gè)新方法[5-6]。

豆清發(fā)酵液是豆腐生產(chǎn)過(guò)程中廢液經(jīng)自然發(fā)酵而形成，俗稱黃漿水、酸水，是一種傳統(tǒng)的天然豆腐凝固劑[5]。以豆清發(fā)酵液點(diǎn)漿的豆腐，不僅質(zhì)地細(xì)膩、持水性好，而且乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸及蛋白酶等物質(zhì)還增加了豆腐獨(dú)特風(fēng)味，并保持了良好的組織狀態(tài)，深受廣大消費(fèi)者歡迎。目前，有關(guān)豆清發(fā)酵液的研究主要集中在其循環(huán)再利用及其產(chǎn)酸發(fā)酵條件優(yōu)化[7-10]，有關(guān)利用豆清蛋白發(fā)酵產(chǎn)乳酸菌細(xì)菌素相關(guān)研究還未見報(bào)道。本文從湖南省傳統(tǒng)豆制品企業(yè)的豆清發(fā)酵液中分離篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定及相關(guān)生物學(xué)特性研究，旨在為其進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)，并為充分利用這些優(yōu)良菌種奠定了基礎(chǔ)，也對(duì)充分挖掘豆清發(fā)酵液的乳酸菌資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

豆清發(fā)酵液（pH值為3.45），采集于湖南省恭兵食品有限公司豆制品生產(chǎn)車間，保存于4℃冰箱備用。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）均保存于邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系。

乳酸菌分離及發(fā)酵培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，吐溫- 80 0.1 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至6.0）；指示菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.2）；胰蛋白酶、胃蛋白酶、過(guò)氧化氫酶、蛋白酶K，購(gòu)自成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司。

SW- CJ- 1D型單人單面潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，寧波久興醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；BA301 Digital型電子顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；VELOCITY18R型高速冷凍離心機(jī)，馭锘實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；IS- RDD3型全溫?fù)u床，美國(guó)精騏有限公司產(chǎn)品；EL20型pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的分離純化

豆清發(fā)酵液樣品（pH值3.45）粗過(guò)濾后，先于37℃下以轉(zhuǎn)速50 r/min搖床培養(yǎng)1 h，然后取搖床培養(yǎng)后樣品用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，并在超凈工作臺(tái)內(nèi)分別取1 mL各梯度稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿，再于皿內(nèi)進(jìn)行MRS培養(yǎng)基倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，于37℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。培養(yǎng)期間觀察是否有明顯溶鈣圈，并挑取特征菌落分離純化，多次革蘭氏鏡檢后與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版[11]進(jìn)行對(duì)比，符合乳酸菌形態(tài)特征的菌株制備發(fā)酵液，打孔法[12]測(cè)定對(duì)指示菌的抑菌活性。

1.2.2菌株產(chǎn)細(xì)菌素的確認(rèn)

除細(xì)菌素外，乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝還可以產(chǎn)生其他具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、雙乙酰等[12-13]。因此，在篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株時(shí)必須排除這些干擾因素，確定抑菌作用是由細(xì)菌素所引起。

（1）有機(jī)酸抑菌作用的排除。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫靜置發(fā)酵2 d，離心收集豆清發(fā)酵上清液，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至6.0。以同pH值乳酸和乙酸為對(duì)照，檢測(cè)抑菌活性。

（2）過(guò)氧化氫抑菌作用的排除。按1∶1體積比例，0.5 mg/mL H2O2酶液加至pH值7.0菌株發(fā)酵上清液，于37℃下恒溫水浴2 h。以原菌株發(fā)酵上清液為對(duì)照，于37℃下培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈大小。重復(fù)3次，求平均值。

（3）細(xì)菌過(guò)濾器除去菌體的干擾。發(fā)酵上清液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器分離雜質(zhì)[14]，收集濾液重復(fù)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察2次抑菌試驗(yàn)中抑菌圈大小是否有顯著差別。

（4）抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性。在排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和菌株菌體干擾后，在發(fā)酵上清液中分別加入2 mg/mL胰蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K 5 mL，隨后分別調(diào)節(jié)pH值至3種最適生長(zhǎng)值。于37℃下滅酶2 h后，將pH值調(diào)至7.0，檢測(cè)抑菌活性。

1.2.3菌株生物學(xué)特性研究

（1）菌株生長(zhǎng)曲線。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫發(fā)酵1 d，每間隔2 h抽取樣品，搖勻測(cè)定發(fā)酵液OD600 nm值，24 h后繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

（2）菌株發(fā)酵產(chǎn)酸。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫發(fā)酵1 d，每間隔2 h抽取樣品，搖勻測(cè)定發(fā)酵液pH值，24 h后繪制菌株的產(chǎn)酸曲線。

（3）菌株的最適生長(zhǎng)溫度。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，分別置于27，32，37，42，47℃恒溫靜置發(fā)酵1 d，搖勻后取樣測(cè)定不同溫度發(fā)酵液的OD600 nm值，確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

（4）菌株對(duì)鹽的耐受性。以2％接種量將活化的菌株接種至分別含3％，5％，7％，9％，11％ NaCl 的MRS液體培養(yǎng)基，于最適生長(zhǎng)溫度下發(fā)酵1 d，搖勻后取樣測(cè)定不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)酵液的OD600 nm值，確定菌株對(duì)鹽的耐受性。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

經(jīng)過(guò)平板反復(fù)劃線，分離得到5株有抑菌圈的乳酸菌，并通過(guò)測(cè)定這5株菌株對(duì)指示菌菌落周圍形成抑菌圈的大小來(lái)判斷抑菌效果的好壞，結(jié)果得到1株抑菌效果最好的菌株，編號(hào)為SQ- 12- 3。

5株菌株對(duì)不同指示菌的抑菌效果見圖1。

2.2菌株SQ- 12- 3的鑒定

2.2.1菌株SQ- 12- 3的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株SQ- 12- 3在培養(yǎng)基上呈乳白色、不透明的圓形小菌落狀，微微隆起，表面光滑，有光澤，菌落邊緣整齊，有較大的溶鈣圈，無(wú)色素，兼性厭氧生長(zhǎng)。革蘭氏染色陽(yáng)性，形態(tài)呈球狀，無(wú)芽孢、鞭毛和莢膜，不運(yùn)動(dòng)，不形成內(nèi)生芽孢，（0.5～0.7 μm）×（0.5～0.7 μm）。

圖1　5株菌株對(duì)不同指示菌的抑菌效果

菌落、菌體形態(tài)及菌株溶圈鈣見圖2。

圖2　菌落、菌體形態(tài)及菌株溶圈鈣

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版、《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》對(duì)菌株SQ- 12- 3進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。菌株SQ-12- 3的菌落及菌體形態(tài)、生理生化特性符合《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中有關(guān)乳酸菌典型菌落特征的描述，初步鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。

2.2.2菌株SQ- 12- 3的生理生化鑒定

菌株SQ- 12- 3的生理生化特性見表1。

表1　菌株SQ- 12- 3的生理生化特性

由表1可知，在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，可以利用乳糖、麥芽糖、蔗糖，不能利用水楊苷和甘露醇；并在生化試驗(yàn)中，接觸酶試驗(yàn)呈陰性、明膠試驗(yàn)陰性、吲哚試驗(yàn)呈陰性及H2S試驗(yàn)呈陰性，甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性。綜合以上，可初步判定菌株SQ- 12- 3為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。

2.3菌株SQ- 12- 3產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

2.3.1有機(jī)酸及過(guò)氧化氫作用的排除

乳酸菌的代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫）會(huì)有一定的抑菌效果。在鑒定菌株SQ- 12- 3的抑菌作用前，要排除這些干擾因素。

菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液和有機(jī)酸的抑菌作用見表2。

表2　菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液和有機(jī)酸的抑菌作用

由表2可知，pH值6.0的乳酸和乙酸對(duì)指示菌均無(wú)抑菌作用，而除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈外，其他指示菌在pH值6.0的發(fā)酵液與原發(fā)酵液的抑菌圈大小差異不明顯，表明在排除有機(jī)酸物質(zhì)后，發(fā)酵液中仍存在其他抑菌物質(zhì)；H2O2酶處理菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液后，其抑菌圈比原發(fā)酵液抑菌圈略有減小，但除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈外，差異仍不明顯，由此說(shuō)明發(fā)酵液中除H2O2外還存在其他抑菌物質(zhì)。

2.3.2菌體干擾的排除

菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無(wú)菌體發(fā)酵液的抑菌作用見表3。

表3　菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無(wú)菌體發(fā)酵液的抑菌作用

在排除菌體干擾試驗(yàn)中，通過(guò)試驗(yàn)比較菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無(wú)菌體發(fā)酵液的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌外，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器處理后抑菌圈與原發(fā)酵液的抑菌圈大小差別基本不明顯，由此說(shuō)明菌體無(wú)抑菌作用。

2.3.3菌株酶穩(wěn)定性的檢測(cè)

發(fā)酵液與酶處理發(fā)酵液的抑菌作用見表4。

表4　發(fā)酵液與酶處理發(fā)酵液的抑菌作用

由表4可知，菌株SQ- 12- 3發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后均無(wú)抑菌作用。由此表明，發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K均非常敏感。初步判定，該抑菌物質(zhì)是一類具有蛋白質(zhì)特性的細(xì)菌素。

2.4菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長(zhǎng)特性研究

菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長(zhǎng)特性動(dòng)態(tài)曲線見圖3。

圖3　菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長(zhǎng)特性動(dòng)態(tài)曲線

由圖3可知，菌株SQ- 12- 3生長(zhǎng)曲線的延滯期為4 h，該時(shí)期活菌數(shù)變化極其微??；4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)呈對(duì)數(shù)增加；16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，該時(shí)期活菌數(shù)最大；20 h后進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。由于延滯期的原因，前4 h內(nèi)菌株pH值變化幅度極?。? h后菌液pH值曲線急劇下降；菌株發(fā)酵18 h后，菌液pH值低至4.11。

2.5菌株最適生長(zhǎng)溫度

菌株SQ- 12- 3最適生長(zhǎng)溫度見圖4。

圖4　菌株SQ- 12- 3最適生長(zhǎng)溫度

由圖4可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，OD600 nm值隨溫度升高，而逐漸升高；當(dāng)溫度到達(dá)37℃時(shí)，OD600 nm值達(dá)到最大；當(dāng)溫度超過(guò)37℃時(shí)，OD600 nm值隨溫度升高而逐漸降低。其原因是乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度是35～43℃，溫度超過(guò)或低于這個(gè)范圍菌株的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，故溫度太低，菌株SQ- 12- 3的生長(zhǎng)速度會(huì)很慢；溫度太高，菌株SQ- 12- 3的活性會(huì)被抑制或喪失，造成菌體死亡。

2.6菌株SQ- 12- 3對(duì)鹽的耐受性

菌株SQ- 12- 3對(duì)鹽的耐受性見圖5。

圖5　菌株SQ- 12- 3對(duì)鹽的耐受性

由圖5可知，在低鹽濃度下，菌株SQ- 12- 3的OD600 nm值無(wú)明顯變化；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％時(shí)，OD600 nm值有下降趨勢(shì)；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)7％時(shí)，菌株SQ- 12- 3的OD600 nm值隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而降低。原因是鹽度增大，菌體的滲透壓增大，會(huì)使細(xì)胞喪失活性，抑制了菌株SQ- 12- 3的生長(zhǎng)。

3結(jié)論與討論

從湖南省傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)副產(chǎn)物豆清發(fā)酵液中分離出的5株菌株，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，根據(jù)菌斑周圍形成的抑菌圈大小挑選得到1株抑菌效果較好的菌株，編號(hào)為SQ- 12- 3。結(jié)合菌株生長(zhǎng)特征、菌體形態(tài)及生理生化性質(zhì)，初步將其鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。乳酸菌可通過(guò)單一的代謝產(chǎn)物或由有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、二乙酰和細(xì)菌素，以及所生產(chǎn)的酶共同起作用[16]。國(guó)內(nèi)外科研人員已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌細(xì)菌素有40余種[17-20]，但只有Nisin得到公認(rèn)并應(yīng)用于生產(chǎn)。通過(guò)排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫及菌株菌體的干擾并檢測(cè)抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性，確定菌株SQ- 12- 3的抑菌活性物質(zhì)為細(xì)菌素。通過(guò)鑒定菌株SQ- 12- 3的一系列生物學(xué)特性，該菌株最適生長(zhǎng)溫度在37℃，菌株在該溫度下發(fā)酵18 h后菌液pH值低至4.11；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7％時(shí)，菌株SQ- 12- 3生長(zhǎng)受到明顯抑制。本研究為菌株的進(jìn)一步發(fā)酵提供理論依據(jù)，并對(duì)從豆清發(fā)酵液中挖掘乳酸菌資源及循環(huán)再利用豆制品企業(yè)廢水等研究均具有重要意義。

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Isolation and Identification of a Bacteriocin- producing Lactococcus sp. Strain Isolated from Fermented Soybean Processing Wastewater

SUN Jing1，ZHANG Chenfei1，*YIN Lebin1，2，KONG Xiaoting1，ZHOU Xinxing1，XIA Qiuliang1，ZHAO Liangzhong1
（1. Department of Biology and Chemical Engineering，Shaoyang University，Shaoyang，Hu'nan 422000，China；2. Soybean Processing Techniques of the Application and Basic Research Base in Hu'nan Province，Shaoyang，Hu'nan 422000，China）

Abstract：A bacteriocin- producing lactic acid bacteria strain designated as SQ- 12- 3 is isolated from natural fermentation broth of a soybean plant. By excluding the disturbances of organic acids and H2O2to antibacterial activity of indicator bacteria，and after the fermentation broth protein stability analysis，the antibacterial substance is determined as bacteriocin. On the basis of the colonies，cells morphology，dissolved calcium circle，physiological and biochemical characteristics，strain SQ- 12- 3 is preliminary identified as Lactococcus sp. The biological characteristics of strain SQ- 12- 3 show that，its optimum growth temperature is at 37℃，after 16 hours fermentation，the pH value reach 4.11 and it has a wider range of salt tolerance. When the NaCl concentration is greater than 7％，and the growth of this strain is significantly inhibited.

Key words：Lactococcus sp.；bacteriocins；fermented soybean processing wastewater

*通訊作者：尹樂斌（1982—），男，博士，講師，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

作者簡(jiǎn)介：孫菁（1994—），女，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

基金項(xiàng)目：湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（2014[445]）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B604）。

收稿日期：2016- 01- 19

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）03a- 0044- 05

中圖分類號(hào)：Q935

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.012