間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體在藥物性肝損傷治療中的作用

邢國(guó)靜， 羅龍龍， 王麗菲， 王順娜， 鄭曉鳳， 盧利霞 ，張久聰

1 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730050

2 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科， 銀川 750001

3 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730030

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指由化學(xué)藥品、生物制品、中成藥等按處方藥或非處方藥管理的藥品，以及中藥材、天然藥物、保健品、膳食補(bǔ)充劑等產(chǎn)品，或其代謝產(chǎn)物乃至其輔料、污染物、雜質(zhì)等所導(dǎo)致的肝損傷［1］，是常見的藥物不良反應(yīng)，可在短期內(nèi)造成肝衰竭，甚至死亡。據(jù)估計(jì)，我國(guó)DILI的年發(fā)生率至少為23.8/10萬(wàn)，高于其他國(guó)家［2］。N-乙酰半胱氨酸、糖皮質(zhì)激素、水飛薊素等藥物雖然對(duì)DILI有一定治療作用，但療效和安全性有一定局限性［3-5］。人工肝作為一種臨時(shí)肝支持系統(tǒng)，因其設(shè)備復(fù)雜、體積大，限制了其應(yīng)用［6］。肝移植是目前唯一有效手段，由于器官供體短缺、免疫排斥反應(yīng)和醫(yī)療費(fèi)用高限制了其應(yīng)用。近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）在DILI治療中的潛在優(yōu)勢(shì)逐漸突顯，越來(lái)越多的研究表明，MSC可通過(guò)其歸巢能力、肝源分化、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌效應(yīng)促進(jìn)肝細(xì)胞再生及減少肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝損傷［3］。MSC來(lái)源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有類似MSC的功能，不僅無(wú)致瘤風(fēng)險(xiǎn)，且具有更低的免疫原性、較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期、良好的滲透性和生物相容性［7］，在肝損傷的治療中頗受關(guān)注。因此，本文將從MSC和MSC-EXO的作用及干預(yù)DILI的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為DILI的診治提供新的思路。

1 MSC及其外泌體概述

1.1 MSC概述 MSC是一種具有紡錘狀結(jié)構(gòu)和塑性底物黏附特性的非造血干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新能力，可分化為中胚層譜系細(xì)胞和其他外胚層譜系細(xì)胞［8］。目前，已從臍帶、月經(jīng)血、脂肪、骨髓等組織中分離出MSC，臨床常用的主要來(lái)源為骨髓、臍帶血和脂肪組織。MSC表達(dá)表面標(biāo)志物CD73、CD90和CD105，但不表達(dá)造血標(biāo)志物CD45、CD34、CD14和CD79［9］。MSC具有多種生物學(xué)作用，如多譜系分化、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、抗凋亡、抗纖維化活性和組織修復(fù)［10-11］；此外，還釋放多種生物活性成分（包括蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、趨化因子、微小RNA（microRNA，miRNA）和細(xì)胞因子），參與組織修復(fù)及再生［12］。MSC如此強(qiáng)大的功能被認(rèn)為是細(xì)胞治療中最有前途的干細(xì)胞類型之一，已在肌肉骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、肝臟、角膜、氣管和皮膚等相關(guān)組織得到廣泛研究和應(yīng)用［13］。

1.2 外泌體概述 外泌體是直徑為40～160 nm的細(xì)胞外囊泡，存在各種體液中并且可由多種細(xì)胞分泌；其攜帶大量生物活性物質(zhì)，如DNA、mRNA、非編碼RNA、脂質(zhì)和各種蛋白質(zhì)，不僅在細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，還在各種病理生理?xiàng)l件下作為診斷性的生物標(biāo)志物和治療載體，具有巨大的潛力［14］。此外，外泌體還含有大量的膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81和CD9）和熱休克蛋白（如Hsp60、Hsp70和Hsp90）［15］。早期研究表明，外泌體在炎癥、細(xì)胞凋亡、凝血、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、抗原呈遞和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等多種生物活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用［16］。MSC-EXO作為MSC旁分泌作用的關(guān)鍵成分，不僅含有細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)脂質(zhì)、mRNA和調(diào)節(jié)性miRNA，還表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑和基質(zhì)金屬蛋白酶9，這些因子在血管生成和組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用［17］。MSC-EXO作為一種新型的無(wú)細(xì)胞療法，已被應(yīng)用于各種疾病模型中，包括神經(jīng)、心血管、免疫、腎臟、肌肉骨骼、肝臟、呼吸系統(tǒng)、眼部和皮膚疾病以及癌癥［18］。

2 MSC及其外泌體移植治療DILI的作用機(jī)制

2.1 減輕肝臟炎癥反應(yīng) 肝細(xì)胞作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分，生理功能獨(dú)特、所處環(huán)境特殊，極易在各種藥物作用下受到侵襲而發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此，有效減輕肝臟炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是緩解肝損傷的重要措施。

在對(duì)乙酰氨基酚（APAP）引起的肝損傷模型中，損傷的肝組織可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白-1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1等，這些細(xì)胞因子可有效誘導(dǎo)MSC遷移到受損肝臟部位，促進(jìn)受損組織修復(fù)［19］。Salomone等［20］給APAP誘導(dǎo)的肝損傷大鼠移植脂肪組織MSC，發(fā)現(xiàn)其可使血漿ALT和AST表達(dá)下調(diào)、凝血酶原時(shí)間減少、血氨水平正常；HE染色顯示肝組織壞死也被完全抑制。人臍帶MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）給藥不僅可以改善APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清ALT水平、病理?yè)p傷；還可抑制肝臟促炎細(xì)胞因子和趨化因子［包括TNF-α，IL-1β，單核細(xì)胞趨化蛋白-1和趨化因子（CXC基序）配體1］mRNA水平，并減少巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞向肝組織浸潤(rùn)。特別是Notch激活的hUC-MSC，可大大增強(qiáng)上述抗炎活性和治療作用［21］。

MSC-EXO是一種重要的旁分泌效應(yīng)體，在組織、器官損傷修復(fù)過(guò)程中可有效降低肝臟炎癥反應(yīng)，避免肝組織進(jìn)一步損傷、惡化。在D-氨基半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，脂肪組織MSC-EXO可通過(guò)抑制miR-17介導(dǎo)的硫氧還蛋白互作蛋白減少肝巨噬細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化來(lái)改善肝臟炎癥反應(yīng)［22］。此外，在TNF-α預(yù)處理后，hUC-MSC釋放大量富含miR-299-3p的外泌體，可通過(guò)抑制NLRP3通路的激活來(lái)減輕炎癥并促進(jìn)肝組織修復(fù)［23］。由此可見，除了MSC和MSC-EXO在減輕肝臟炎癥反應(yīng)，維持肝臟穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用；外泌體相關(guān)非編碼RNA也在肝臟保護(hù)作用方面發(fā)揮重要作用，為肝損傷的治療提供了新的方向和依據(jù)。

2.2 促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及再生 肝臟損傷后，肝細(xì)胞增殖及再生是肝臟從損傷中恢復(fù)所依賴的一個(gè)重要過(guò)程，在肝細(xì)胞存活和肝穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，也是治療DILI的重要途徑。MSC遷移至受損肝臟后發(fā)生肝源分化，并釋放生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-6、纖維蛋白原和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及再生［24］。在胺碘酮誘導(dǎo)的體內(nèi)外肝損傷模型中，脂肪組織MSC不僅可以增加損傷肝細(xì)胞的細(xì)胞活力、阻止細(xì)胞凋亡途徑的激活、刺激啟動(dòng)期基因的表達(dá)，還可使免疫細(xì)胞浸潤(rùn)減少及再生反應(yīng)增強(qiáng)，顯著減弱小鼠肝損傷［25］。

MSC-EXO也可有效促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及再生，阻止DILI的進(jìn)展。在采用APAP和H2O2誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷模型和CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的小鼠模型中觀察到，人類胚胎MSC-EXO干預(yù)后，啟動(dòng)期因子表達(dá)增加、細(xì)胞活力得到改善、肝臟再生基因［核因子（NF）-κB、cyclin D1和cyclin E］和細(xì)胞增殖標(biāo)志物（增殖細(xì)胞核抗原）的表達(dá)明顯上調(diào)［26］。因此，不管是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，MSC及MSC-EXO均可改善受損肝臟，并刺激剩余的肝細(xì)胞再生和恢復(fù)，延緩疾病進(jìn)展。

2.3 抗肝細(xì)胞凋亡作用 細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)控的細(xì)胞死亡形式，是許多穩(wěn)態(tài)和病理所必需的流程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控。Liu等［27］證實(shí)hUC-MSC移植可使D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色陽(yáng)性細(xì)胞減少、Bcl-xl/Bax蛋白比率增加、裂解半胱天冬酶-3和TNF-α水平下調(diào)。

自噬是由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞分解代謝過(guò)程，在維持肝細(xì)胞和代謝穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。骨髓MSC-EXO通過(guò)增加自噬標(biāo)記蛋白（微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ、Beclin-1）的表達(dá)促進(jìn)自噬體的形成，在自噬體的誘導(dǎo)下促凋亡蛋白Bax和裂解半胱天冬酶-3的表達(dá)水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平上調(diào)，顯著減輕D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和凋亡，提高存活率［28］。另有研究［29］發(fā)現(xiàn)，hUCMSC-EXO可通過(guò)激活胰島素樣生長(zhǎng)因子-1/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2信號(hào)通路，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。近些年，關(guān)于MSC及MSC-EXO的研究尚處于起步階段，其抗凋亡所涉及的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。

2.4 改善氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是多種肝臟疾病常見的病理生理基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激失衡即可影響DILI的進(jìn)展。越來(lái)越多的證據(jù)表明MSC和MSC-EXO在治療肝損傷過(guò)程中可通過(guò)降低氧化應(yīng)激發(fā)揮其治療作用。Huang等［30］證實(shí)小鼠視網(wǎng)膜脂肪組織MSC可抑制細(xì)胞色素P450活性、減少毒性硝基酪氨酸的積累、增加抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶）活性及抗氧化因子（核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1）基因的表達(dá)來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞免受APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。深入研究發(fā)現(xiàn)這與下游MAPK信號(hào)激活被抑制和炎性細(xì)胞因子（IL-1α、IL-1β）的產(chǎn)生密切相關(guān)。另有研究［31］證實(shí)hUC-MSC條件培養(yǎng)基可通過(guò)下調(diào)miR-486-5p和上調(diào)絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白Pim-1減輕H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與抑制TGF-β/Smad通路有關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明MSC-EXO可減輕損傷肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究人員［32］在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中比較了hUC-MSCEXO與保肝劑（聯(lián)芬雙酯）的抗氧化作用，結(jié)果顯示，hUCMSC-EXO具有更明顯的抗氧化和保肝作用。更重要的是，hUC-MSC-Ex可通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路改善氧化應(yīng)激，如在CCl4和H2O2誘導(dǎo)的肝損傷模型中，hUC-MSC-Ex可通過(guò)上調(diào)ERK1/2和Bcl-2及下調(diào)IκB激酶B/NF-κB/胱天蛋白酶-9/-3途徑，并輸送谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1以改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［33］。

2.5 免疫調(diào)節(jié)作用 免疫失衡是肝損傷重要的發(fā)病機(jī)制。在炎癥組織部位，MSC可以直接影響先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和活性，誘導(dǎo)肝組織修復(fù)和再生。一項(xiàng)刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型的研究［34］表明，扁桃體MSC通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低損傷小鼠血清炎癥因子（TNF-α、TNF-γ和IL-4）水平，并增加肝保護(hù)因子IL-10的血清水平。Wang等［35］證實(shí)骨髓MSC分泌的前列腺素E2可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M1（促炎）向M2（抗炎）表型極化，減少促炎因子的釋放，抑制D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡。骨髓MSC還可通過(guò)下調(diào)肝臟自然殺傷T淋巴細(xì)胞中的IL-17及增加產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性自然殺傷T淋巴細(xì)胞數(shù)量減弱CCl4誘導(dǎo)的急性肝衰竭［36］。此外，MSC還可通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的募集和活性，改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的大鼠肝功能，降低病死率［37］。MSC對(duì)適應(yīng)性免疫細(xì)胞（如T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞）的增殖和活化作用也被研究所證實(shí)［38］。

MSC-EXO也參與DILI的免疫調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)IL-6預(yù)處理可顯著上調(diào)hUC-MSC-EXO中miR-455-3p的水平，這些外泌體通過(guò)下調(diào)靶基因PIK3r1，抑制巨噬細(xì)胞活化。在小鼠內(nèi)毒素血癥和化學(xué)性肝損傷模型中，過(guò)表達(dá)miR-455-3p可減輕肝損傷、減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及血清炎癥因子水平，改善肝損傷［39］。小鼠骨髓MSC-EXO可通過(guò)減弱Kupffer細(xì)胞M1型極化，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的體內(nèi)外肝組織修復(fù)［40］。由此可見，MSC和MSCEXO均可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，有效抑制促炎免疫細(xì)胞的活化及促炎細(xì)胞因子分泌，阻斷免疫反應(yīng)的級(jí)聯(lián)活性，恢復(fù)肝臟免疫穩(wěn)態(tài)。

3 MSC-EXO移植治療其他肝臟疾病的作用機(jī)制

MSC-EXO除了在DILI中具有保護(hù)作用，在其他肝病中也發(fā)揮重要作用。如在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中，hUC-MSC-EXO通過(guò)遞送miR-148a靶向巨噬細(xì)胞中的Kruppel樣因子6/信號(hào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活因子3途徑發(fā)揮抗纖維化作用［41］。在非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物和細(xì)胞模型中，hUC-MSC-EXO被證實(shí)可通過(guò)減少細(xì)胞脂質(zhì)沉積，減輕肝損傷［42］。在缺血/再灌注肝損傷模型中，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源MSC-EXO通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、減少炎癥因子的釋放、改善氧化應(yīng)激，減輕肝細(xì)胞壞死和凋亡［43］。近年來(lái)，MSC-EXO對(duì)腫瘤的作用一直是研究熱點(diǎn)，其在肝癌治療中展現(xiàn)出“雙刃劍”作用，一方面可抑制腫瘤生長(zhǎng)，另一方面也可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和遷移［44］。

4 MSC及其外泌體在疾病治療中的局限與挑戰(zhàn)

如上所述，MSC移植在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可有效減輕肝損傷，但研究［45］表明，MSC在受損組織區(qū)域的存活率低，移植潛力低和潛在的致瘤性也限制了其在組織修復(fù)中的有效性。此外，MSC在接受體外預(yù)處理（如化學(xué)試劑、缺氧或炎癥）后可增加療效，但這些因素的適用劑量及是否會(huì)對(duì)MSC產(chǎn)生不利影響尚不清楚［46］。MSC-EXO在疾病的治療中顯示出良好的應(yīng)用前景，但也存在很多挑戰(zhàn)：（1）尚無(wú)統(tǒng)一的分離、純化技術(shù)來(lái)獲得外泌體；（2）分離的外泌體其儲(chǔ)存以及運(yùn)輸條件的系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)和方案尚未建立；（3）外泌體注射的最佳劑量和注射頻率尚不確定；（4）外泌體來(lái)源多樣、成分復(fù)雜，目前尚無(wú)法確定改善DILI的具體物質(zhì)；（5）大多數(shù)研究都是短期的，長(zhǎng)期治療效果未知。綜上，雖然MSC-EXO在再生醫(yī)學(xué)方面理論上優(yōu)于MSC，但仍需要更多的臨床前實(shí)驗(yàn)和基礎(chǔ)研究來(lái)克服外泌體在治療應(yīng)用中的局限性。

圖1 MSC及MSC-EXO移植治療DILI的作用機(jī)制Figure 1 The mechanism of MSC and MSC-EXO transplantation in the treatment of DILI

5 小結(jié)與展望

MSC-EXO作為無(wú)細(xì)胞療法，為DILI提供了一類有效的治療方法，為改善肝損傷、逆轉(zhuǎn)肝衰竭和改善預(yù)后提供了新的方向。盡管臨床前研究中的絕大多數(shù)陽(yáng)性結(jié)果尚未轉(zhuǎn)化為臨床療效，相信隨著相關(guān)技術(shù)的日益成熟，MSC-EXO背后分子機(jī)制不斷深入研究，MSC-EXO的治療潛力可以得到充分發(fā)揮。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：邢國(guó)靜負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫論文；王麗菲、羅龍龍、王順娜、鄭曉鳳參與修改論文；盧利霞、張久聰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。