C/EBPs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子在高三酰甘油血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺中的表達

鄭俊媛　吳江紅　陳靜　劉杰　胡國勇　王興鵬　曾悅

200080　上海，上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院消化科

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·論著·

C/EBPs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子在高三酰甘油血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺中的表達

鄭俊媛吳江紅陳靜劉杰胡國勇王興鵬曾悅

200080上海，上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院消化科

【摘要】目的探討C/EBPα、C/EBPβ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子(IRE1α和sXBP1)在高三酰甘油血癥(HTG)相關性急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺中的表達變化。方法96只SD大鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組、HTG組(高脂飲食2周)、AP組、HTG+AP組，每組24只。采用腹腔注射雨蛙肽方法制備AP模型，造模后3、6、9、24 h分批處死大鼠。觀察胰腺病理變化并予評分，檢測血清TG、總膽固醇(TC)及血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實時PCR法檢測胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα和C/EBPβ蛋白表達，免疫組化法檢測胰腺組織C/EBPα和C/EBPβ蛋白表達。結果高脂飲食2周后，HTG組、HTG+AP組大鼠血清TG和TC均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。HTG+AP組胰腺病理變化較AP組更嚴重，以9 h點表現(xiàn)最為顯著(P<0.05)。與AP組比較，HTG+AP組血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，9 h點差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.011、0.034、0.027)。AP組和HTG+AP組胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達均于3 h點開始升高，分別于24、9、6、6 h點達峰值。與AP組比較，HTG+AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達明顯更高，其中IRE1α、sXBP1 mRNA 3、6、9、24 h點，C/EBPα mRNA 6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA 6、9 h點差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AP組和HTG+AP組胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均于3 h點開始上調(diào)，9 h點達最高水平，HTG+AP組較AP組上調(diào)更顯著；HTG+AP組6 、9 h點C/EBPα、C/EBPβ蛋白高表達，AP組則無表達。結論C/EBPα、C/EBPβ、IRE1α、sXBP1基因參與HTG相關性AP的發(fā)病，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路IRE1α/sXBP1和C/EBPα、C/EBPβ可能共同介導HTG性AP的胰腺病理損傷和炎癥過程。

【關鍵詞】胰腺炎；C/EBPα；C/EBPβ；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；高酯血癥；大鼠

高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是急性胰腺炎(AP)發(fā)病的一個僅次于膽源性和酒精性、明確而獨立的危險因素。HTG性AP占所有AP病例的10%，在妊娠期AP中的比例則高達50%[1]。HTG性AP的病情重癥化和炎性反應擴大化[2]早有定論，但具體機制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來在細胞生物學層面上提出的一個較新穎的AP發(fā)病機制，而高脂飲食本身也能夠誘發(fā)肝臟、脂肪、骨骼肌等組織發(fā)生ERS[3]，尤其是與脂代謝和炎癥都有關聯(lián)的IRE1α-sXBP1通路[4]。C/EBPs(CCAAT enhancer binding proteins)是一個包括C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPξ 6個成員的轉(zhuǎn)錄因子家族，其C端都具有高度保守的、堿性亮氨酸拉鏈結構的DNA結合域和二聚化功能域，N端則為轉(zhuǎn)錄激活域。該家族具有調(diào)控細胞增殖和分化、能量代謝、炎癥、學習和記憶等多種功能。本研究檢測ERS相關分子(IRE1α、sXBP1)和C/EBPα、C/EBPβ在HTG性AP胰腺組織的表達，分析它們間的關系。

材料和方法

一、動物模型制備和實驗分組

96只雄性SD大鼠，SPF級，體重150～ 160 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。按數(shù)字表法隨機分為對照組、AP組、HTG組、HTG+AP組，每組24只大鼠。對照組給予正常飲食喂養(yǎng)；AP組給予正常飲食喂養(yǎng)2周后采用腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg體重2次、間隔1 h的方法制備AP模型；HTG組給予高脂飼料(正常飼料77%+豬油20%+膽固醇3%)喂養(yǎng)2周； HTG+AP組給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后同上述方法制備AP模型。對照組和HTG組腹腔注射等容積生理鹽水。AP誘發(fā)后3、6、9、24 h處死大鼠，腹主動脈采血，分離血漿，置-20℃保存；取胰腺組織，部分立即置液氮保存，部分用10%甲醛固定備用。

二、血三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、IL-1β、IL-6、TNF-α檢測

正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)2周后大鼠尾靜脈采血，分離血清送上海市第一人民醫(yī)院生物化學實驗室檢測血TG、TC水平，分離的血漿應用ELISA試劑盒(eBioscience)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按說明書操作。

三、胰腺組織病理檢查

取固定的胰腺組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下讀片，并參照Schmidt等[5]的胰腺組織病理評分標準進行評分。

四、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA檢測

應用Trizol(Invitrogen)抽提胰腺組織總RNA，應用RT試劑盒和SYBGreen熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)進行逆轉(zhuǎn)錄及實時PCR反應，按說明書操作。 IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、β-actin引物由上海生工生物技術有限公司設計并合成，引物序列和退火溫度見表1。 通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

表1　各基因引物序列及退火溫度

五、胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白檢測

應用RIPA裂解液提取胰腺組織總蛋白，用核蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術有限公司)提取核蛋白，應用BCA試劑盒(碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達量，以Tubulin為內(nèi)參，最后ECL(Millipore公司)化學發(fā)光。 兔抗大鼠 IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ抗體購自Santa Cruz公司，工作濃度分別為1∶250、1∶400、1∶400、1∶250、1∶250；羊抗兔IgG-HRP購自Jackson公司，工作濃度1∶5 000。應用天能Tanon 5200全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白表達量。

取固定的胰腺組織，石蠟包埋、切片，采用免疫組化方法檢測C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達，最后DAB顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下讀片。以胞質(zhì)和(或)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。蛋白表達強度結果判定標準：無染色為陰性，陽性細胞占全片1/3以下為弱陽性，占全片1/3 ～2/3為陽性，占全片2/3以上為強陽性。

六、統(tǒng)計學分析

結果

一、血清TG、TC水平及胰腺組織病理變化

對照組、AP組、HTG組、HTG+AP組血清TG分別為(0.67±0.25)、(0.64±0.18)、(4.41±0.94)、(4.45±0.84)mmol/L；TC分別為(2.17±0.20)、(2.19±0.30)、(2.87±0.45)、(2.96±0.55)mmol/L。兩高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠的TG、TC水平均顯著高于兩正常飼料喂養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計學意義(TG：t值分別為9.378、10.784，P值均<0.001；TC：t值分別為3.184、2.765，P值均<0.05)。

對照組和HTG組的胰腺組織病理無明顯變化，病理評分基本為0分。AP組和HTG+AP組胰腺組織均出現(xiàn)不同程度的水腫、出血、壞死和炎性浸潤，尤以9 h點病變最為嚴重。AP組胰腺組織病理評分顯著高于對照組，HTG+AP組則顯著高于HTG組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。HTG+AP組的胰腺病理改變較AP組更嚴重，尤以水腫和腺泡壞死為甚(t=3.464，P=0.026；t=5.292，P=0.006)。HTG+AP組胰腺病理總評分、水腫和壞死評分較AP組同時點顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而出血和炎性浸潤評分差異僅在9 h點有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖1，表2)。

圖1　對照組(1A )、 AP 9 h組(1B)、HTG組(1C)、HTG+AP 9 h組(1D)大鼠胰腺組織病理改變(HE　×400)

二、血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平的變化

HTG組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義。AP組、HTG+AP組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組、HTG組顯著升高，HTG+AP組又較AP組顯著升高。兩組9 h時的IL-1β分別為(115.31±3.09)、(62.58±1.32)ng/L；IL-6為(43.20±3.81)、(22.41±2.40)ng/L；TNF-α為(38.75±1.02)、(22.11±1.10)ng/L，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.495、2.709、3.328，P值分別為0.011、0.034、0.027；圖2)。

三、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達變化

與對照組比較，HTG組大鼠胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達呈現(xiàn)不同程度上調(diào)，但僅6、9、24 h點C/EBPα mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達均較對照組升高，其中IRE1α mRNA在9、24 h點，sXBP1 mRNA在6、9、24 h點，C/EBPα mRNA在3、6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA在3、6 h的差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。 HTG+AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA也均較HTG組表達升高，其中IRE1α、sXBP1、C/EBPα mRNA在3、6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA在3、6 h點的差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表3)。

四、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB蛋白表達的變化

HTG組和對照組大鼠胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB蛋白均低表達或未檢測到表達。AP組IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均較對照組增加； HTG+AP組IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均較HTG組、AP組增加。HTG+AP組C/EBPα和C/EBPβ蛋白高表達，其中C/EBPα蛋白6、9、24 h點，C/EBPβ蛋白3、6 h點表達均較AP組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，圖3)。

表2　AP組和HTG+AP組大鼠胰腺組織病理評分

注：與AP組同時點比較，aP<0.05

注：與AP組比較，aP<0.05

組別只數(shù)IRE1αmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.021.09±0.151.07±0.071.04±0.03HTG組241.26±0.131.20±0.011.24±0.101.24±0.14AP組241.04±0.011.29±0.022.67±0.08a4.93±0.19aHTG+AP組242.88±0.07bc3.55±0.04bc4.99±0.12bc5.86±0.04bc組別只數(shù)sXBP1mRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.021.30±0.201.29±0.110.89±0.08HTG組241.46±0.171.67±0.091.59±0.141.49±0.22AP組242.25±0.357.89±0.89a16.08±1.48a14.12±1.06aHTG+AP組247.29±2.08bc20.55±1.21bc25.56±1.38bc21.66±0.23bc組別只數(shù)C/EBPαmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.011.01±0.130.84±0.081.06±0.05HTG組241.31±0.124.03±1.00a4.89±0.97a4.44±0.86aAP組2411.16±2.17a16.68±3.11a15.67±2.65a11.08±1.77aHTG+AP組247.58±2.58c29.94±3.40bc21.90±1.93bc16.68±0.33bc組別只數(shù)C/EBPβmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.101.82±0.051.66±0.021.00±0.01HTG組242.89±0.233.61±0.313.27±0.111.66±0.44AP組248.17±1.50a10.56±1.61a2.57±0.691.00±0.07HTG+AP組248.64±1.25c18.13±2.09bc3.63±0.22b3.12±0.58

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05；與HTG組比較，cP<0.05

圖3　對照組(1)、HTG組(2)及AP組(3)、HTG+AP組(4)3、6、9、24 h點胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達

免疫組化染色顯示，HTG+AP組6、9 h點C/EBPα和C/EBPβ呈強陽性表達，而AP組則無表達(圖4)，與蛋白質(zhì)印跡法檢測的結果一致。

討論

目前已有不少研究[6]發(fā)現(xiàn)，在多種AP模型中均存在ERS，包括ERS標志分子的mRNA和蛋白表達上調(diào)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、液化和腔內(nèi)出現(xiàn)大量空泡等形態(tài)結構的改變。ERS信號通路主要包括IRE1α-sXBP1、PERK-eIF2α和ATF6，其中IRE1α-sXBP1是ERS最經(jīng)典最保守的一條信號通路，且與炎癥、糖脂代謝紊亂和脂肪細胞分化等都有密切關系[4,7]。Zhang等[8]采用蛋白質(zhì)組學技術發(fā)現(xiàn)，與正常血脂的大鼠AP比較，HTG相關性AP大鼠胰腺的ERS相關蛋白，如GRP78等的表達顯著升高。本課題組前期研究結果也顯示[9]，HTG性AP的GRP78、sXBP1mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)，腺泡細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度擴張、空泡化，推測ERS可能是HTG性AP重癥化的一個重要機制。

近年來，肥胖、糖尿病、HTG等多種脂肪代謝性疾病在全球范圍內(nèi)的流行使人們越來越關注脂肪沉積調(diào)控的機制研究，其中就包括調(diào)控脂肪細胞分化、葡萄糖和胰島素代謝以及高密度脂蛋白(HDL)生成的C/EBPα和C/EBPβ[10]。研究表明， 生脂基因調(diào)控因子C/EBPα和C/EBPβ還可調(diào)控炎性通路[11-12]。C/EBPα可通過激活巨噬細胞加重炎性反應[13]，但也是對抗炎性疾病的一個保護因子[14]。C/EBPβ可以上調(diào)炎性因子的表達加重神經(jīng)炎性疾病和急性肺損傷[15-16]。高脂飲食能誘導脂肪細胞和巨噬細胞C/EBPβ的高表達進而上調(diào)IL-6、TNF-α、MCP1等炎性因子表達，而敲除C/EBPβ基因則可減輕高脂飲食誘發(fā)的炎癥和胰島素抵抗[17]。Ji等[18]

圖4　對照組(4A)、AP 9 h組(4B)、HTG組(4C)、HTG+AP 9 h組(4D)大鼠胰腺組織C/EBPα(上)、C/EBPβ(下)的表達(免疫組化　×400)

應用基因芯片技術檢測AP大鼠胰腺組織，發(fā)現(xiàn)1 h后C/EBPβ基因表達上調(diào)，是正常大鼠的8倍，2 h高達正常的16倍，4 h則是正常的9倍；而注射牛黃膽酸1 h后胰腺組織C/EBPβ基因上調(diào)至正常的17倍，3 h高達正常的20倍。

文獻報道C/EBPβ與ERS、炎癥和代謝障礙都有密切的聯(lián)系[10]，ERS可誘導C/EBPβ高表達，C/EBPβ可誘導NF-κB和炎性因子表達上調(diào)[17]。但尚無有關ERS和C/EBPα關系的文獻報道，且有關C/EBPα和C/EBPβ關系的報道也只限于在脂肪細胞分化過程中C/EBPβ誘導C/EBPα的表達。

本研究結果顯示，HTG+AP組的胰腺病理損傷更嚴重，血漿中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平更高，胰腺組織NF-κB的蛋白表達增強，證明HTG加重了AP的全身炎癥反應和胰腺病理損傷。HTG+AP組胰腺IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB表達上調(diào)，血中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，進一步驗證ERS參與了HTG加重AP的過程。至于HTG性AP中IRE1α-sXBP1是否誘導C/EBPα和C/EBPβ的高表達，進而激活NF-κB，加重炎癥反應還有待進一步研究證實。

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(本文編輯：呂芳萍)

Alteration of C/EBPs and endoplasmic reticulum stress related molecules expression in pancreatic tissues in rats with hypertriglyceridemia related acute pancreatitis

ZhengJunyuan,WuJianghong,ChenJing,LiuJie,HuGuoyong,WangXingpeng,ZengYue.DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

【Abstract】Objective To investigate the alteration of C/EBP α, C/EBP β and endoplasmic reticulum stress (ERS) related molecules (IRE1 α and sXBP1) expression in pancreatic tissues in rats with hypertriglyceridemia related acute pancreatitis. MethodsNinety six Sprague Dawley (SD) rats were divided into 4 groups: control group, hypertriglyceridemia (HTG) group (n=24, fed with high fat diet for 2 weeks), AP group (n=24), HTG+AP group (n=24), and AP was induced by peritoneal injection of cerulein. The rats were sacrificed at 3, 6, 9, 24 h after AP induction, respectively. The pathological changes of the pancreatic tissues were observed and scored by HE staining. Plasma levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α weremeasured by ELISA. The expression of IRE1α, sXBP1, C/EBPα, C/EBPβ mRNA were analyzed by real time PCR. The expressions of IRE1α, sXBP1, NF-kB, C/EBPα and C/EBPβ protein were determined by Western Blot. The expressions of C/EBPα and C/EBPβ proteins were also determined by immunohitochemistry. ResultsAfter two weeks of high fat diet, serum levels of triglyceride(TG) and total cholesterol (TC) in HTG group, HTG+AP group were much higher than those of the control group, and the difference was statistically significant (P<0.05). The pancreatic tissue injury was more severe in HTG +AP group, particularly at 9 h (P<0.05). And plasma IL-1β, IL-6 and TNF-α levels were also much higher in HTG+AP group when compared with that of AP group, the differences were all significant at 9 h (P=0.011; P=0.034; P=0.027). After AP induction, IRE1, sXBP1, C/EBP and C/EBPβ mRNA began to be up-regulated at 3 h, and IRE1 mRNA reached the highest level at 24 h, sXBP1 mRNA at 9 h, while C/EBP and C/EBPβ mRNA reached the highest level at 6 h. Compared with AP group, IRE1, sXBP1, C/EBP and C/EBPβ mRNA levels were much higher in HTG+AP group. In addition, as to IRE1 and sXBP1 mRNA, the difference was significant at 3, 6, 9, 24 h, and C/EBP mRNA at 6, 9, 24 h, C/EBPβ mRNA at 6 and 9 h (P<0.05). After AP induction, IRE1α, sXBP1 and NF-kB proteins in the pancreatic tissue began to be up-regulated at 3 h, and all reached the highest level at 9 h. IRE1α, sXBP1 and NF-kB proteins were up-regulated more obviously in HTG+AP group, and the up-regulation in HTG+AP group was higher than that in AP group, and the high expressions of C/EBPα and C/EBPβ proteins could only be detected at 6 and 9 h in the HTG+AP group, while there was no expression detected in AP group. ConclusionsC/EBPα, C/EBPβ, IRE1α and sXBP1 may be involved in the pathogenesis of HTG related AP, and IRE1α/sXBP1 pathway and C/EBPα, C/EBPβ may mediate the pathologic injury and inflammation process of HTG related AP.

【Key words】Pancreatitis;C/EBPα;C/EBPβ;Endoplasmic reticulum stress;Hyperlipidemias;Rats

(收稿日期：2015-06-29)

Corresponding author:Zeng Yue, Email: carrie@medmail.com.cn

基金項目：國家自然科學基金青年項目(81200322)；上海市自然科學基金面上項目(12ZR1424000)；上海市胰腺疾病重點實驗室開放課題資助項目(SPDF2013004)

通信作者：曾悅，Email：carrie@medmail.com.cn

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.007

Fund program：Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81200322); Shanghai Natural Science Foundation(12ZR1424000)；Open Project of Shanghai Key Laboratory of Pancreatic Diseases (SPDF2013004)